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,,,(450001):、。、,,。、,。:;;;;:R97811:A:100623765(2009)201020005204:郭家瑞,女(1984-)。在读硕士研究生,研究方向为微生物与生化药学,联系电话:13526551283*通讯作者:王卫国(教授),Email:wwgwang@yahoo1com1cn基金项目:河南工业大学引进人才专项(2007BS023)ResearchProgressonGentamicinGUOJia2rui,WANGWei2guo,LILei,HEHong2liang(BioengineeringDepartment,HenanUniversityofTechnolo2gy,Zhengzhou450001,China)ABSTRACT:Gentamicin,anaminoglycosideantibiotic,isgeneratedbyMicro2monosporapurpureaandAeromonassmallspikes1Ithasbeenwidelyusedclinicallybecauseofitsantimicrobialbroad2spectrumandan2tibacterialactivity,especiallyforitshighertherapeuticeffectongram2negativebacteria1Thispaperoutlinedthere2searchsituationonthegentamicinfermentationprocessanditsisolationandpurificationmethodsbothathomeandabroadinrecentyears1Atthesametime,theapplicationsandprospectsofgentamicinwerediscussedwiththepresentactualsituation1KEYWORDS:Gentamicin;Fermentationtechnology;Isolationandpurification;Clinicalapplications;Developmentprospects20世纪20年代末青霉素的发现,开辟了抗生素化疗的新时代,随后,各种抗生素的研制、开发与利用迅速发展,从此,抗生素在许多疾病的治疗中占有举足轻重的地位。在众多抗生素中,以庆大霉素为代表的氨基糖苷类抗生素由于其抗菌谱广、抗菌活性强而被广泛用于临床。庆大霉素是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的一种杀菌力较强的广谱抗菌素,目前被广泛用于临床,因此,庆大霉素的相关研究一直是国内外众多学者研究的热点。本文就庆大霉素的结构与特性、发酵生产以及提纯的研究现状进行了综述,同时还对庆大霉素的应用与发展前景进行了展望。1111庆大霉素的化学组成庆大霉素是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的氨基糖苷类抗生素,是由22脱氧链霉胺、绛红糖胺、加拉糖胺组成的多组分混合物,并以C族复合物为主。22脱氧链霉胺分别在4、6位上通过苷键连接绛红糖胺和加拉糖胺,因绛红糖胺C6c上的甲基化程度不同,形成了C1、C2、C1a3个主要组分112,其结构122如图1所示。1C1:R1=NHMe,R2=MeC2:R1=NH2,R2=MeC1a:R1=NH2,R2=H这3个组分中,C1、C2、C1a的疗效和毒性互不相同:C1组分毒副作用最小且不易产生耐药性,但疗效稍差;C2和C1a组分疗效高,但毒性较大且容易产生耐药性。112庆大霉素的抗菌特性庆大霉素呈碱性、易溶于水、性状稳定,与硫酸结合成临床上使用的硫酸庆大霉素。它的抗菌谱较广,对绿脓杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素雷杆菌和志贺菌等革兰氏阴性菌有抗菌作用,而且对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌也有很强的抗菌作用;其抗菌作用机理是直接与30S核糖体亚单位16rRNA的解码区的A部位结合,从而导致菌体死亡。但是,随着庆大霉素的广泛使用,一些细菌逐渐对其产生了耐药性,JakobsenL等132曾报道了120株对庆大霉素耐药的大肠埃希菌的最小抑菌浓度(MIC)和耐药机制的关系。2#5#StraitPharmaceuticalJournalVol21No1102009庆大霉素是采用深层液态发酵法生产的,国内使用的生产菌种一般是绛红小单孢菌,而国外通常使用棘孢小单孢菌、橄榄星小单孢菌。庆大霉素自生产以来,生产水平并不高,国内一般在1200~1500u#mL-1,国外的生产水平也只在1600~1800u#mL-1,且发酵周期较长、产素率低、成本高。因此,为了提高庆大霉素的生产水平、降低成本,几十年来,各国抗生素工作者都做了不懈的努力,也取得了丰硕的成果。总的来说,他们的研究主要集中在四个方面:一是高产菌株的筛选;二是培养基的优化;三是发酵工艺的研究;四是庆大霉素胞外分泌的研究。211高产菌株的筛选我国1965年从福州土壤中分离出了庆大霉素生产菌种小单孢菌,但原始菌种发酵单位低,质量也不稳定。多年以来,很多抗生素工作者一直都在探讨如何选育发酵单位高,质量稳定的庆大霉素生产菌。研究者多从诱变育种这一角度来筛选庆大霉素高产菌株。杨丽142曾对庆大霉素生产菌种JY1212进行了紫外诱变处理,后经摇瓶筛选并分离得到新菌株JY325;诱变菌株JY325使摇瓶效价提高了3413%,生产罐实验的发酵效价提高了1816%。而刘峰等152采用12C离子束辐射选育庆大霉素高产菌株获得成功,生产发酵单位达1300u#mL-1以上。另外,离子注入技术作为一种新技术应用非常广泛,而其应用于生物诱变是近年来发展起来的16,72;赵洪英等182采用N+离子束注入技术来诱变庆大霉素生产菌,筛选到的诱变菌株比出发菌株的产量提高27139%。在诱变育种中,采用相关或非相关抗生素的抗性选择性筛选,是一条快速得到突变株和高产株的捷径19,102。吴健等1112以生产菌株绛红小单孢菌为出发株,应用N+离子注入及紫外线诱变技术,同时利用高浓度的庆大霉素梯度平板进行筛选,筛选到摇瓶效价分别比出发菌株提高7512%和7011%的N08和Wt63两个高产菌株,10L发酵罐发酵产量分别达2118u#mL-1和1843u#mL-1。此外,张家骊等1122使用硫酸二乙酯(DES)和微波处理出发菌株MicronozporaEchinoz2pora0721,且采取抗性平板以及摇瓶动态选育两种方式,考察了使用DES和微波来诱变庆大霉素生产菌株的可行性。结果表明,出发菌株对微波诱变不很敏感,而且突变株遗传稳定性较差;而传统的DES化学诱变对于实验菌株具有良好的诱变效选育效果,并且结合动态选育得到的优良菌株,产量高而且稳定,是理想的诱变选育方法。虽然诱变育种操作起来简单可行,但它也有自身的缺点,如诱变产生的有益突变体频率低、难以有效地控制变异的方向和性质等。因此,诱变育种应该与其他技术相结合,同时谋求技术上的自我完善。另外,近年来,随着分子生物学技术的发展以及在微生物基因组计划的推动下,国内外对放线菌的抗生素合成、调节和转运基因已经进行了大量卓有成效的研究,因此,通过对庆大霉素生物合成基因的克隆与转移来提高其增产是很有发展前景的。212培养基的优化培养基提供了菌体生长和形成产物所必需的营养和能量,在建立一个高效的发酵过程之前,通常都要对培养基进行优化。冯爱梅1132做了关于培养基中黄豆饼粉不同含量的实验,发现培养基中黄豆饼粉的含量在310%左右时最有利于庆大霉素的发酵。熊小彪等1142在实验中改变培养基中的葡萄糖与淀粉的比值,但维持二者的总含量615%不变,发酵至120h测效价,结果表明,葡萄糖与淀粉的比值控制在0101时对庆大霉素发酵的总效价有一定程度的提高。此外,研究表明氨基酸脱去氨基后形成的碳骨架可以进入TCA循环且能增加TCA循环的代谢通量,从而提高了细胞的能量水平,可促进细胞生长和代谢产物合成115,162,因此在抗生素的合成过程中可添加一些氨基酸来提高其发酵水平。管玉霞等1172在庆大霉素的原发酵培养基中加入了甘氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、酪氨酸四种氨基酸,在整个发酵过程中用料减少,发酵周期缩短了40%左右,产素率提高30%~90%。213发酵工艺的改进发酵工艺的改进对发酵水平的提高也有至关重要的作用。王静1182的研究表明,氧的供给对庆大霉素发酵的影响很大,如果供氧不足,发酵液中就会出现大量的菌丝团,而且发酵液的pH值也会下降,导致再发酵过程中发生阻遏现象。刘峰等1192在庆大霉素发酵后期将补水工艺改为补胨水(蛋白胨014%),和原工艺比较发现,新工艺发酵液的生物效价较原工艺提高了3123%。214庆大霉素胞外分泌的研究长期以来,对于提高庆大霉素产量的研究多集中在高产菌株选育和发酵工艺的改进上,虽然取得了一定的成就,但效果不甚理想。据此,许多研究集中在庆大霉素的分泌机理上。研究表明,菌体分泌产生的庆大霉素一部分是和菌丝体紧密结合在一起。Reiblein等1202研究发现庆大霉素与菌丝体之间是非特异性结合,而且使用超声波可以有利于菌丝体释放庆大霉素,但并不能使其完全释放;李柏林等1212曾进一步探讨了庆大霉素在菌体内的存在方式,指出胞内庆大霉素主要被菌丝体细胞壁吸附,从而使得胞内庆大霉素浓度远大于胞外浓度;牛文泽等1222研究了棘孢小单胞菌绛红变种细胞壁肽聚糖对庆大霉素的吸附作用,指出肽聚糖吸附的庆大霉素占细胞壁吸附总量的95%左右,并且在发酵过程中添加一些金属离子(Mg2+、Na+等)可以起到解吸附作用。另外,熊小彪等1142在研究中发现,在培养基中添加一些能增加细胞膜通透性的物质会使庆大霉素的分泌率提高;而且还推断,细胞膜通透性的增加会使膜内的庆大霉素透过膜与细胞壁结合,当细胞壁结合的庆大霉素达到一定浓度时就会向胞外分泌。由此可见,膜的通透性是影响庆大霉素分泌的一个重要因素。而熊小彪等1232研究了微波处理对庆大霉素分泌的影响,发现经微波12715W、40s多次处理后分泌率为4715%,而其总效价提高幅度可高达48105%。目前研究已证明,庆大霉素是在膜内合成之后分泌到膜外并被细胞壁吸附,因此可知,提高庆大霉素的胞外分泌率是一种增加庆大霉素产量的有效途径。为此,可从两方面入手:一是增加细胞膜的通透性;二是通过在线机械振荡方式分离庆大霉素。3庆大霉素是一种碱性、水溶性很强的氨基糖苷类抗生素,目前常用离子交换法对其进行提取分离及纯化。国外采用弱#6#海峡药学2009年第21卷第10期酸性离子交换树脂,但国内大多数工厂生产上都采用强酸732树脂,静态吸附、动态解吸。随着对庆大霉素提纯方法的不断研究,出现了许多新的方法技术,如泡沫分离法、反胶束萃取法、沉淀法以及膜分离法等。311离子交换法离子交换法是提取庆大霉素发酵液的一种最普遍的方法,其一般工艺流程(见图2)。2离子交换树脂是常用的离子交换材料,而离子交换纤维是近年来新兴的离子交换材料,与离子交换树脂相比,其交换面积更大,交换速度也更高。李夏兰等1242研究了羧酸型离子交换纤维吸附庆大霉素的性能,发现在pH8左右其静态交换容量可达3122@104u#g-1;对发酵液中庆大霉素的动态交换容量为2101@104u#g-1,洗脱率为9217%。312泡沫分离法泡沫分离法是借助于表面活性剂的界面作用分离浓缩溶质和净化液相主体的技术,已用于环境废水中重金属的处理1252,生物蛋白质、酶及微生物的分离纯化126,272。目前泡沫分离法也越来越多地用于抗生素分离纯化中。潘焕华等1282分别采用了相当于发酵液的庆大霉素配制液和实际发酵液对泡沫分离法进行了研究,发现用SDS(十二烷基硫酸钠)与AEO29(烷基醇聚氧乙烯醚)的混合表面活性剂处理的庆大霉素收率最高,故选用SDS作为捕集剂;此外,还发现用泡沫分离法分离配制液中庆大霉素的收率为72%,分离实际发酵液中庆大霉素的收率为60%。而王丰莉等1292在用泡沫分离法对庆大霉素进行提取时,则