吸附层析

吸附层析吸附层析(adsorptionchromatography)又称吸附色谱，是利用固定相吸附物中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附层析的层析过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附物的过程。目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。1903年俄国植物学家茨维特首先将磷酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是最早期的吸附层析磷酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤吸附层析的发现吸附层析类型吸附层析一般可根据操作不同分为：吸附柱层析、薄层层析、薄膜层析三类。二、基本原理在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点；吸附位点通过范德瓦尔力(中性分子彼此距离非常近时，产生的一种微弱电磁引力)和静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合；其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。例如把含结构不同的A、B二种物质的混合溶液加至装有吸附剂的层析柱(见图3-2)；而后，注入适宜的洗脱剂，控制速度让其下流；便可借助A、B两种物质对吸附剂结合力的差异性，将它们二者分离。假如吸附剂对A的结合力小于B时，则B留在柱子上部，A移至柱子的下部。也可以说，A、B二物质在柱上得以分离，是由于A、B二物质在固定相(吸附剂)与流动相(洗脱剂)之间的分配系数不同所致。如果A物质分配系数小于B物质时，则A在柱子上移动的速度大于B。因此，混合物在层析柱中的分离过程，实质上是吸附、解吸附、再吸附的连续过程，或者是在固定相与流动相之间连续分配的过程。分配系数和迁移率分配系数(K):是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。迁移率:是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。几种物质之间的分配系数或迁移率,其差异程度越大，分离效果就越好。一、吸附柱层析吸附柱层析：是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析方法。1、吸附剂1.1吸附剂的选择吸附剂应具备：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性好和成本低廉等性能。在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说，极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是、为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。否则反之。要选择一个理想的吸附剂必须经过多次试验才能获得常用的吸附剂有：极性吸附剂和非极性吸附剂两种。极性吸附剂：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等。非极性吸附剂：主要是活性炭。吸附剂的分类1.1几种极性吸附剂的简要介绍(1)硅胶硅胶是应用最广泛的一种极性吸附剂，具有多孔性网状结构，它的主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量，容易制备不同类型，孔径，表面积的多孔性硅胶。硅胶的吸附能力与吸附物的性质有关，硅胶能吸附非极性化合物，也能吸附极性化合物，对极性化合物的吸附能力更大。硅胶的吸附能力与其本身的含水量密切相关，硅胶吸附活性随含水量的增加而降低，当含水量小于1%时，活性最高，而当含水量大于20%时，硅胶的吸附活性最低。硅胶表面上带有大量的羟基，有很强的亲水性，能吸附多量水分，因此硅胶一般于105～110摄氏度活化1～2小时后使用，活化后的硅胶应马上使用。用过的硅胶用5～10倍量的1%NaOH水溶液回流30min，热过滤，然后用蒸馏水洗3次，再用3～6倍量的5%乙酸回流30min，过滤，用蒸馏水洗至中性，再用甲醇洗，水洗两次，然后在120摄氏度烘干活化12h，即可重新使用。（2）氧化铝氧化铝也是一种常见的极性吸附剂，它具有较高的吸附容量，分离效果好，特别适用于亲脂性成分的分离，活性氧化铝价廉，再生容易，活性容易控制，但操作不便，手续繁琐，处理量有限，因此也限制了在工业生产上的大规模应用。氧化铝通常可按制备方法的不同分为以下三种：碱性氧化铝：直接由氢氧化铝高温脱水而得，柱层析时一般用100～150目。碱性氧化铝主要用于碳氢化合物的分离。中性氧化铝：中性氧化铝使用范围最广，常用于分离脂溶性生物碱，脂类，大分子有机酸以及酸碱溶液中不稳定的化合物的分离。酸性氧化铝：适用于天然和合成的酸性色素，某些醛和酸，酸性氨基酸和多肽的分离。氧化铝的吸附活性也与含水量的关系很大，吸附能力随含水量增多而降低。和硅胶相似，氧化铝在使用前也需在一定条件下（1500C下2h）除去水分以使其活化。（3）羟基磷灰石羟基磷灰石又名羟基磷酸钙，简称HA，在无机吸附剂中羟基磷灰石是唯一适用于生物活性高分子物质（如蛋白质，核酸）分离的吸附剂。有时有些样品如RNA，双链DNA，单链DNA和杂型双链DNA-RNA等，经过一次羟基磷灰石柱层析，就能达到有效的分离。（4）人造沸石人造沸石是人工合成的一种无机阳离子交换剂，使用过的人造沸石也可以再生使用。1.2非极性吸附剂活性炭介绍活性炭具有吸附力强，来源比较容易，价格便宜等优点，常用于生物产物的脱色和除臭，还应用于糖，氨基酸，多肽及脂肪酸等的分离提取。活性炭的种类很多，一般分为以下三种：粉末活性炭：该类活性炭颗粒极细，呈粉末状，其总表面积大，是活性炭中吸附力最强的一类。颗粒活性炭：该类活性炭颗粒较前者大，其总表面积相应减小，吸附能力次于粉末活性炭。锦纶活性炭：该类活性炭是以锦纶为黏合剂，将粉末活性炭制成颗粒，吸附力较上两者弱，可用于分离前两种活性炭吸附太强而不容易洗脱的化合物。由于活性炭是一种强吸附剂，对气体的吸附能力很大，气体分子占据了活性炭的吸附表面，会造成活性炭“中毒”，使其活力降低，因此使用前可加热烘干，以除去大部分气体。对于一般的活性炭可在1600C加热干燥4~5h，锦纶活性炭受热容易变形，可于1000C干燥4~5h。羟基磷灰石是唯一适用于生物活性高分子物质（如蛋白质，核酸）分离的吸附剂。有时有些样品如RNA，双链DNA，单链DNA和杂型双链DNA-RNA等，经过一次羟基磷灰石柱层析，就能达到有效的分离。（4）人造沸石人造沸石是人工合成的一种无机阳离子交换剂，使用过的人造沸石也可以再生使用。羟基磷灰石是唯一适用于生物活性高分子物质（如蛋白质，核酸）分离的吸附剂。有时有些样品如RNA，双链DNA，单链DNA和杂型双链DNA-RNA等，经过一次羟基磷灰石柱层析，就能达到有效的分离。（4）人造沸石人造沸石是人工合成的一种无机阳离子交换剂，使用过的人造沸石也可以再生使用。在吸附层析中用的洗脱剂是液体。通常它也是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。合适的洗脱剂应符合下列条件：①纯度较高；②稳定性好；③能较完全洗脱下所分离的成分；④黏度小；⑤易和所需要的成分分开。2、洗脱剂洗脱剂的选择：根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。一般蛋白质或核酸被极性强的羟基磷灰石吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱。甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。所用洗脱剂的梯度浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯醚氯仿苯四氯化碳和己烷。为了能得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。几种层析柱3、操作步骤3.1装柱装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱后，层析柱中基质应符合如下标准：填装均匀、松紧一致、没有气泡装柱的方法分干装法和湿装法两种：干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒人溶剂，此法不易将气泡排尽。而湿装法系先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾人柱中(见图3-5)，待其自然沉降至柱高的1／4—1／3时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。后一种装柱法对各种基质都适用。装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在约50cm高的操作压下(见第五章)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。3.2．上样和洗脱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5cm计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始洗脱(见图3-6)。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。3.3绘制出洗脱曲线根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标)。理想的洗脱曲线如图3-7所示。图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(EFG)、峰高(BE)和半峰高的宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。4.1纯化生命物质使用吸附剂的柱层析或分批吸附法(见实例1)可纯化生命物质。如用羟基磷灰石吸附剂能把酸性、中性和碱性蛋白质分开，也能把不同结构的核酸分开(见图3-8)。用该吸附剂分离含不同磷酸基团的蛋白质和脂类等化合物也是有效的。4、应用4.2分离蛋白质的亚基一般蛋白质经SDS(十二烷基硫酸钠)或TritonX-100(聚氧乙基十六烷基酚醚)等去污剂处理后，会产生分子质量不同的蛋白质亚基。这些物质可通过吸附柱层析方法得到分离(见图3-9)。4.3浓缩溶液有些稀的溶液经层析柱处理后，浓度可大幅度提高。例如，Tiselius把200ml稀的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)溶液上HA层析柱，收集到的洗脱液仅有几毫升，其浓度提高数十倍。二、薄层层析薄层层析(thinlayerchromatography，TLC)：是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。基本原理：吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样，放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。经过在吸附剂和展开剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。1、吸附剂2、展开剂柱色谱中提到的吸附剂都可以用作为薄层色谱的固定相，分离性能及使用选择同柱色谱的选择原则相同。一般用于薄层色谱时，要求吸附剂的粒度更小。薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。展开剂的极性越大，对化合物的洗脱力也越大。3、迁移率Rf=l1/l0l0l1l21、薄层板的制备操作步骤薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g硅胶，加入5—6ml蒸馏水，调成糊状。将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。2、点样先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，吹干。斑点直径一般不超过2mm。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点间距离应为0.5-1cm，且不能离边沿太近。点样要轻，不可刺破薄层。3、展开薄层层析的展开，需要在密闭容器中进行。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下（点样面朝上），浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。吹干，观察斑点位置，计算Rf值。4、显色分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个