3-转化与扩增

第二章分子克隆单元操作2.22.32.1克隆载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5基因工程的操作过程切接转增检一、用于基因转移的受体（宿主）二、转化与扩增2.3转化与扩增一、用于基因转移的受体（宿主）分子克隆用宿主应具备的条件各种基因工程受体（宿主）的特性实验室常用的基因工程受体1、分子克隆用宿主应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-，recB-，recC-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外野生型细菌一般不能作为受体细胞，需要进行改造基因工程主要宿主系统原核细胞(Prokaryotic)真菌（Fungus)昆虫(Baculovirus)高等真核细胞（Eukaryotic)人（基因治疗）动、植物（基因农场）2、各种基因工程受体（宿主）的特性1）大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。适用于外源DNA的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基因的高效表达，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。产生结构复杂、种类繁多的内毒素。各种基因工程受体的特性2）枯草芽孢杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表达，。遗传欠稳定，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性3）链霉菌抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性4）酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性5）昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达DNA重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性6）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢各种基因工程受体的特性7）植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良遗传操作繁琐3、实验室常用的基因工程受体（宿主）大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、DH5α、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654真菌哺乳动物细胞CHO毕赤酵母、汉森酵母、啤酒酵母酵母菌：丝状真菌：黑曲霉、青霉二、转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增几个基本概念感受态（compentent)：受体(宿主）细胞经过一些理化或生物学方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA进入的一种生理状态。感受态细胞（compententcell)转化（transformation)：外源DNA导入特定受体（宿主）细胞，并使之繁殖和表达的操作。转化子（transformant)：经转化而带有外源DNA的受体（宿主）细胞。重组子（recombinant)：含有重组DNA的转化子。相对于仅含空载体的转化子而言。1、转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化（Ca2+法）细菌原生质体的转化（原生质体法）完整细菌细胞的电穿孔转化（电转化法）l噬菌体DNA的转染1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，转化混合物中的DNA与其形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为感受态。大肠杆菌感受态细胞的制备：100ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液悬浮菌体冰浴放置12-24小时，备用收集菌体大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组冰浴放置半小时在42℃保温90秒（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟DNA连接液，混匀加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选2）细菌原生质体的转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂细菌原生质体的制备：取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20mlDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀细菌原生质体的转化：细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素3）电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验4）l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选2、转化率转化率的定义每微克DNA分子转化宿主菌能获得的转化子数。例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：104/107X10-2=0.1mg载体DNA考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：0.1/20%=0.5mg载体DNA转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高转化方法方面：受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ngDNA转化方法：Ca2+诱导转化106-107/mgDNA原生质体转化109个原生质体50ngDNA原生质体转化105-106/mgDNAl-DNA转染107-108/mgDNA电穿孔转化106-109/mgDNA3、转化细胞的扩增扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序使载体分子上的标记基因扩增和表达，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定第二章分子克隆单元操作2.22.32.1克隆载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5基因工程的操作过程切接转增检转化子的筛选和鉴定的必要性由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子转化子重组子目的重组子经转化扩增单元操作后的受体细胞总数（包括转化子与非转化子）已达109~1010，需要从中选出期望重组子概念转化子筛选和鉴定流程1、筛选选择性平板筛选转化子重组子目的重组子非转化子2、重组子初步鉴定显色、PCR、比大小、酶切、分子杂交、生物/免疫学活性3、重组子确证DNA序列分析4、外源基因表达产物检测仅当外源基因克隆于特定表达载体和宿主中时才需要。常规基因克隆则否。1、抗药性筛选法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr绝大多数载体的抗性标记用于筛选转化子，但pBR322可筛选重组子：pBR3224363bpori可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在PstI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Aps、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs一、利用载体表型选择双抗药性标记筛选法的基本操作：如Tc插入失活先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为ApAp+Tc影印对照挑选重组子较为简便的选择方法背景知识具体选择过程2、营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理：营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子氨基酸核苷酸常见的营养缺陷型筛选标记：哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型dCDPdTDPdTTP胸腺嘧啶核苷dTMPdTDPdTTPAPTKAP氨基喋呤TK胸腺嘧啶核苷激酶3、显色筛选法显色筛选法的基本原理：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等显色筛选法蓝白斑筛选法的基本操作：pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重组子（Apr+lacZ-）将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落