06 第六章 以酶为靶点的药物设计

第六章以酶为靶点的药物设计生物技术教研室生物体内各种化学反应几乎都是在特异的生物催化剂帮助下完成的。随着人类基因组计划的完成以及生物信息学、药物基因组学和药物蛋白质组学研究的不断深入，预计未来将有3000种以上的酶类靶标应用于药物设计与研究中。本章将在简要介绍酶的功能与作用的基础上，重点讨论有关酶抑制剂的合理药物设计。第一节酶的基础知识第二节酶抑制剂第三节几种酶抑制剂的设计与应用第六章以酶为靶点的药物设计第一节酶的基础知识第一节酶的基础知识一、酶的基本定义与分类二、酶促反应动力学特征三、酶的激活与抑制一、酶的基本定义与分类1.酶的概念酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。酶相对于一般催化剂而言具有高效性、专一性、敏感性和可调性。2.酶的分类①按化学组成可将酶分为：单纯蛋白质和缀合蛋白质。②按酶蛋白分子的特点可分为：单体酶、寡聚酶和多酶复合体。③根据酶催化反应的类型可分为：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。3.酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。4.酶促反应的特点①酶促反应具有极高的效率酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activationenergy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。反应总能量改变非催化反应活化能酶促反应活化能一般催化剂催化反应的活化能能量反应过程底物产物酶促反应活化能的改变活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的特异性可大致分为以下3种类型：绝对特异性(absolutespecificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物。相对特异性(relativespecificity)：作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性(stereospecificity)：作用于立体异构体中的一种。绝对特异性脲酶、L-精氨酸酶：L-精氨酸L-鸟氨酸+尿素NH2C=O+H2OCO2+2NH3NH2NH2C=ONHCH3相对特异性多数酶可对一类化合物或一种化学键起催化作用，这种对底物分子不太严格的选择性称为相对特异性（relativespecificity）。脂肪酶不仅水解脂肪，也可水解简单的酯。胰蛋白酶水解由碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）的羧基所形成的肽键。人体内有多种蛋白激酶，它们均催化底物蛋白质丝氨酸（或苏氨酸）残基上羟基的磷酸化蛋白激酶共有序列蛋白激酶A-X-R-(R/K)-X-(S/T)-X-蛋白激酶C-X-(R/K1-3,X0-2)-(S/T)-(X0-2,R/K1-3)-X蛋白激酶G-X-(R/K)2-3-X-(S/T)-X-Ca2+/钙调素蛋白激酶H-X-R-X-X-(S/T)-X-立体结构特异性酶对空间构型所具有的特异性要求称为空间异构特异性（stereospecificity）延胡索酸酶仅对延胡索酸(反丁烯二酸)起催化作用，将其加水生成苹果酸，对顺丁烯二酸则无作用HOOCCHHOOCCH+H2OHOOCCHHCCOOH+H2OCH2COOHCHCOOHOHL-Mal延胡索酸酶延胡索酸③酶促反应的可调节性对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节。二、酶促反应动力学特征概念研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。※研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。1.底物浓度对反应速度的影响I.单底物、单产物反应II.酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示III.反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度IV.底物浓度远远大于酶浓度研究前提在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax（1）米－曼氏方程式中间产物酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)ＶVmax[S]Km+[S]＝──米－曼氏方程式推导基于两个假设：E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即V＝k3[ES]。(1)S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。推导过程稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即[ES]恒定。K1([Et]－[ES])[S]＝K2[ES]+K3[ES]K2+K3＝Km（米氏常数）K1令：则(2)变为:([Et]－[ES])[S]＝Km[ES](2)＝([Et]－[ES])[S]K2+K3[ES]K1整理得：当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速度Vmax＝K3[ES]＝K3[Et](5)[ES]＝───[Et][S]Km+[S](3)整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式：Vmax[S]Km+[S]V＝────将(3)代入(1)得K3[Et][S]Km+[S](4)V＝────当反应速度为最大反应速度一半时Km值的推导Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2（2）Km与Vmax的意义Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。②意义：a)Km是酶的特征性常数之一；b)Km可近似表示酶对底物的亲和力；c)同一酶对于不同底物有不同的Km值。Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3[E]如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数K3。定义—当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。意义—可用来比较每单位酶的催化能力。酶的转换数（3）Ｋm值与Ｖmax值的测定a.双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法Vmax[S]Km+[S]V=（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]两边同取倒数b.Hanes作图法[S][S]/V-KmKm/Vm在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax2.多底物的酶促反应动力学领先底物释放释放A和Q竞争地与自由酶结合（1）序列反应或单－置换反应①有序反应（orderedreactions）②随机反应（randomreactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应序列机制的底物动力学方程及动力学图——在B的浓度达到饱和时A的米氏常数——在A的浓度达到饱和时B的米氏常数——底物A与酶结合的解离常数——底物A、B都达到饱和时最大反应速率AAEPE’PEE’QEQEBBA和Q竞争自由酶E形式B和P竞争修饰酶形式E’A和Q不同E’结合B和P也不与E结合。(2)乒乓反应或双－置换反应乒乓机制的底物动力学方程及动力学图——在B的浓度达到饱和时A的米氏常数——在A的浓度达到饱和时B的米氏常数——底物A、B都达到饱和时最大反应速率3.酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K3[E]0V[E]当[S][E]时，Vmax=k3[E]酶浓度对反应速度的影响双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。4.温度对反应速度的影响最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。*低温的应用酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC温度对淀粉酶活性的影响5.pH对反应速度的影响最适pH(optimumpH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性pHpH对某些酶活性的影响胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶2468106.激活剂对酶反应速度的影响能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(activator)，其中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg++是多种激酶和合成酶的激活剂，动物唾液中的α-淀粉酶则受Cl-的激活。特点：1、酶对激活剂有一定的选择性，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂2、有一定的浓度要求，当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂。三、酶的激活与抑制酶的激活作用大体可以分为酶原的激活、酶的变构激活（变构调节）以及酶的共价修饰等三种方式。1.酶的激活①酶原与酶原的激活酶原(zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。酶原激活的机理酶原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SSSS肠激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活过程酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。②酶的变构激活•变构效应剂(allostericeffector)变构激活剂变构抑制剂变构效应•变构酶(allostericenzyme)•变构部位(allostericsite)一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，称为变构效应。变构酶常为多个亚基构成的寡聚体，具有协同效应变构激活变构抑制变构酶的Ｓ形曲线[S]V无变构效应剂③酶的共价修饰激活共价修饰(covalentmodification)在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化－SH与－S－S互变酶的磷酸化与脱磷酸化-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白2.酶的抑制作用酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。区别于酶的变性•抑制剂对酶有一定选择性•引起变性的因素对酶没有选择性抑制作用的类型不可逆性抑制(irreversibleinhibition)可逆性抑制(reversibleinhibition)：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)(一)不可逆性抑制作用*概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。*举例有机磷化合物羟基酶解毒------解