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第四章遗传的分子基础§4.2DNA的提取和鉴定1.了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。2.尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取及鉴定。3.培养实事求是的科学态度和探索精神。1.DNA粗提取的选材，思路和鉴定原理是什么？2.DNA与蛋白质的性质差异如何？3.破碎动物细胞和植物细胞的方法有何不同？4.根据DNA在NaCl溶液中的溶解度不同如何控制其溶解和析出？5.DNA粗提取和鉴定的步骤是什么？认真阅读教学案,思考以下问题：NaCl1．DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的_____溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。此外，DNA不溶于_____溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于_____。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2．蛋白酶能水解_____，但是对_____没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在________才会变性。洗涤剂能够瓦解________，但对DNA没有影响。3．在______条件下，DNA遇______会被染成___色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。酒精酒精蛋白质DNA80oC以上细胞膜沸水浴二苯胺蓝§4.2DNA的提取和鉴定DNA从哪提取？怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？怎样鉴定我们提取的DNA？【实验原理】1.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.酸性条件下，DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。2mol/L0.015mol/L【实验材料】1、鸡血细胞液（5~10ml）；2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；3、蒸馏水；4、质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸钠溶液；（抗凝剂）5、物质的量浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的NaCl溶液；6、二苯胺试剂。【实验过程】制备鸡血细胞液过滤含有DNA的氯化钠溶液提取含杂质较少的DNADNA的鉴定析出含DNA的粘稠物滤取含DNA的黏稠物再溶解DNA的黏稠物提取鸡血细胞的核物质溶解滤液中的DNA课前制备：鸡血细胞液b.鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长3.选择鸡血做实验材料的原因:a.鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得1.实验材料的选取:2.选材：新鲜的猪血新鲜的鸡血原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。（×）（√）→哺乳动物成熟红细胞无细胞核，DNA含量极少不易提取4.制备鸡血细胞液过程：取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）5.柠檬酸钠作用：防止血液凝固6.实验时，为什么用吸管除去离心管上部的澄清液？血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞。离心后上清液是血浆（不含有血细胞），除去它就可以得到鸡血细胞液。DNA容易被玻璃容器吸附，所以最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液7.注意事项：步骤1.提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL，取其滤液。讨论：（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？分析：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA步骤2.溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态步骤3.析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol／L）讨论：加入蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕注意事项：步骤4.滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上步骤5.将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽多地溶解于溶液中步骤6.过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中步骤7.提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95％的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？步骤8.DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015mol／L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色（2）这一鉴定结果说明什么问题？（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA（3）DNA的直径约为20×10-10m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？答：DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的答：整个实验共第1次：步骤1.细胞吸水胀破第2次：步骤3.使DNA黏稠物析出此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤？几次析出？几次搅拌？分别在哪一步？【实验总结】两次蒸馏水：三次过滤：两次析出：六次搅拌：两次蒸馏水：过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层三次过滤：第1次：步骤1.DNA存在于滤液里第2次：步骤4.DNA被留在纱布上第3次：步骤6.DNA存在于滤液里两次析出：第1次：步骤3.用0.14mol／L的NaCI溶液（含杂质多）第2次：步骤7.用冷却的95％的酒精六次搅拌：其中除第8步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA第1、2、3、5、7步【思维拓展】如果以植物（菜花，洋葱）为实验材料，如何进行DNA的粗提取和鉴定？植物细胞需要加入一定的洗涤剂和食盐。实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解B1．在蛋白质和DNA的混合液中，要想得到较纯的DNA，可采用的方法有()。①向混合液中加入足量的蒸馏水②向混合液中加入DNA水解酶③向混合液中加入冷的95％的酒精④向混合液中加入蛋白质酶A．①②B．③④C．①③D．②④2．在“DNA的粗提取和鉴定”实验中有三次过滤：(1)过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液；(2)过滤含黏稠物的0．14mol／LNaCI液；(3)过滤溶解有DNA的2mol／LNaC[溶液。以上三次过滤分别为了获得()A.含核物质的滤液,纱布上的黏稠物,含DNA的滤液B.含核物质的滤液,滤液中DNA黏稠物,含DNA的滤液C.含核物质的滤液,滤液中DNA黏稠物,纱布上的DNAD.含较纯的DNA的滤液,纱布上的黏稠物,含DNA的滤液A