DNA连接酶

第四节DNA连接酶生物化学与分子生物学*******•DNA连接酶旧称“合成酶”，是1967在大肠杆菌细胞中发现的。•DNA连接酶催化双链DNA链一条链上切口的连接，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。4.1什么是DNA连接酶？DNA连接酶的作用前提•两条链，且切口处DNA链5’端有-PO4，3’端有-OH注意事项：DNA连接酶是封闭双链DNA骨架上的缺口（nick），即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口（gap），即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂DNA连接酶的作用需要能量•在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用NAD＋[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸]作能源的•而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源DNA连接酶反应的3个步骤•NAD或ATP与酶分子中特定的Lys残基的ω-氨基酸连接，两者都形成酶-AMP中间物•活化的中间产物AMP转移到切口5’-PO4，形成焦磷酸键•3’–OH发生亲核攻击，形成磷酸二酯键，AMP释放，DNA切口共价链接DNA连接酶的用途•DNA连接酶主要用于基因工程，将由限制性核酸内切酶“剪”出的粘性末端重新组合，故也称“基因针线”•外源DNA连接到载体上，，进而导入到受体细胞•大肠杆菌DNA连接酶•T4DNA连接酶（常用）•热稳定DNA连接酶4.2DNA连接酶的种类4.2.1大肠杆菌DNA连接酶•大肠杆菌DNA连接酶是一条多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解，水解后形成的小片段仍具有部份活性。•在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用备注：先前认为大肠杆菌DNA连接酶只能够连接粘性末端，但是目前也发现可以连接平末端，但是连接效果不好加入10-15%的PEG（聚合剂）和高浓度的K+可以提高连接效率4.2.2T4DNA连接酶•T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，可催化双链DNA的粘性末端、平末端及RNA-DNA杂合体中单链的连接，在分子生物学中有广泛的应用•其热稳定性较差，最适连接温度是16℃,在实验室中使用较为广泛催化双链DNA的粘性末端连接5‘…G--C--T--C--T--G--C--AG--G--A--G…3’3‘…C--G--A—GA--C--G--T--C--C--T--C…5’OHPPOH5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C…5’nicknickDNA连接酶连接平末端双链DNA分子5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C…5’P-C--A--G--G--A--G…3’OH-G--T--C--C--T--C…5’DNA连接酶5‘…G--C--T--C--T--G-OH3‘…C--G--A--G--A--C-PRNA-DNA杂合体链上切口处的连接5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--GA--C--G--T--C--C--T--C…5’5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C…5’POHDNA连接酶nickRNA4.2.3热稳定DNA连接酶•热稳定DNA连接酶是从嗜热高温放线菌菌株中分离纯化的，一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶。在85℃高温下都具有连接酶的活性，而且在重复多次升温到94℃之后也仍然保持连接酶的活性•在基因克隆中具有重要作用。比如PCR几种DNA连接酶的比较大肠杆菌DNA连接酶T4DNA连接酶热稳定DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体高温放线菌能源辅助因子NAD+ATPATP功能主要催化DNA黏性末端的连接黏性末端、平末端均可连接DNA复制中起连接作用•用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段•用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来•先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。共同点：都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭双链DNA的功能4.3体外连接DNA片段的方式•黏性末端的连接•平末端的连接4.3体外连接DNA片段的方式•同种内切酶产生的黏性末端的连接•同尾酶产生的黏性末端的连接•不同黏性末端的连接4.3.1黏性末端的连接同种内切酶产生的黏性末端的连接GAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'EcoRIGCTTAA5'5'AATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG5'AATTCGGCTTAA5'T4DNA连接酶退火GCTTAAGCTTAA5'AATTCG5'AATTCG同尾酶产生的黏性末端的连接TGATCAACTAGT5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'5'BclIBamHITACTAG5'5'GATCATGCCTAGGATCCGT4DNA连接酶退火GCCTAGGATCCG5'GATCATTACTAG5'GCCTAGGATCCG5'GATCATGCTTAA5'不同黏性末端的连接CTGCAGGACGTC5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'5'BamHIPstICTGCAG5'5'GACGTCGCCTAGGATCCGT4-DNApol切平Klenow补平CG5'5'GCGGATCCCTAGGATCCCTAGGT4DNAligaseGCCTAGGATCCG5'GATCGCCGCTAG5'GCCTAGGATCCG5'GATCGCCGCTAG5'4.3.2平末端的直接连接•从分子动力学的角度讲，黏性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法•加大连接酶用量（10倍于黏性末端的连接）•加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会•加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用•加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM•平末端的直接连接•末端修饰后的连接•加上连杆（linker），使之形成黏性末端后，再用DNA连接酶连接•DNA接头(adapter)连接法4.3.2平末端的连接直接用T4DNA连接酶连接平末端5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C…5’P-C--A--G--G--A--G…3’OH-G--T--C--C--T--C…5’T4DNA连接酶5‘…G--C--T--C--T--G-OH3‘…C--G--A--G--A--C-PDNA片段末端同聚物加尾后连接GCATG3’C5'5'C3’GTACGTdTdCTPTdTdGTPGCATGCCCCCC3’C5'5'C3’CCCCCCGTACG退火KlenowT4DNAligasePstISphICTGCA3'GG3'ACGTC5'5'CTGCAGGGGGG3'GG3'GGGGGGACGTC5'5'CTGCAGGGGGGGGGGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCCC5'5'CCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGGGGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCCC5'5'CCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGACGTTGCAGGGGGGGACGTCGCATGCCCCCCCGTAC5'5'CATGCCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGACGTTGCAGGGGGGGACGTCGCATGCCCCCCCGTAC5'5'CATGCCCCCCCGTACGPstI酶切位点加上连杆后再连接•如果重组体DNA是用平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么很可能无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用连杆法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。•所谓连杆(1inker)，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。•DNA片段末端加上化学合成的连杆，能形成黏性末端，连接后可用内切酶进行切割。原理：连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有连杆的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的黏性末端。于是便可以按照常规的黏性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。缺点：如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的连杆相同的限制位点，这样在酶切消化连杆产生黏性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。改进方法：改用其它类型的连杆，或者用DNA接头(adapter)连接法。DNA接头(adapter)连接法于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。吴瑞（1928-2008）2008年2月10日，吴瑞教授在康奈尔大学去世。