DNA重组及重组DNA技术(一)

掌握：基因芯片、蛋白质芯片、基因文库的概念；※酵母双杂交技术、※标签蛋白沉淀原理及应用；△染色质免疫沉淀技术的基本原理及应用。了解：基因芯片和蛋白质芯片的基本原理、EMSA基本原理。标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图GST:谷胱甘肽S-转移酶酵母转录激活因子GAL4的结构DNA结合域(bindingdomain,BD)转录激活域(activationdomain,AD)GAL4（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途猎物DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章DNA重组和重组DNA技术掌握：△同源重组、接合、转化、转导的基本概念；重组DNA技术（基因工程，DNA克隆）※II型限制性核酸内切酶；※载体※基因工程操作过程：分、选、接、转、筛；真核表达体系常用的受体细胞和转染方法；△原核表达体系的缺点。了解：特异位点的重组；转座重组；基因工程技术在医学中的应用。•DNA重组（DNArecombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。第一节自然界DNA重组和基因转移DNARecombinationandGeneTransferinNatureDNA重组•同源重组(homologousrecombination)•位点特异的重组(site-specificrecombination)•转座重组(transpositionrecombination)•接合作用(conjugation)•转化作用(transformation)•转导作用(transduction)原核生物发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型一、同源重组是最基本的DNA重组方式同源重组在DNA损伤修复中的作用同源重组产生的染色质片段交换减数分裂中的同源重组安吉丽娜·朱莉于2013年5月14日公布自己已经接受预防性双乳腺切除手术。朱莉透露做出如此重大的决定的原因：她的母亲与乳腺癌抗争多年，仍不幸在56岁病逝。而她经检测发现自己与母亲一样都存在基因BRCA1/2突变，患乳腺癌的几率高达87%，因而选择了预防性切除手术。1964年提出Holliday模型分支移动Holliday连接体Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：※内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体片段重组体片段重组体切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：※•参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。•RecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。•RecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA复合物。•RuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。应用:基因敲除二、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。F因子介导的接合作用接合作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。Wheninjectedintomice,theencapsulatedstrainofpneumococcusislethal.Griffith'sexperimentin1928whereasthenonencapsulatedstrainisharmless.AveryAvery–MacLeod–McCartyexperimentin1944（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。Lambda-噬菌体生活周期普遍性转导：供体菌DNA被包装入噬菌体特异性转导：整合入噬菌体再转移至受体菌思考题1.当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞转移至另一细胞或细菌，这种类型的DNA转移称为：A.接合作用B.转导作用C.转化作用D.转座重组E.特异位点重组2.通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是：A.接合作用B.转导作用C.转化作用D.转座重组E.特异位点重组第二节重组DNA技术RecombinantDNATechnology重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。DNA克隆技术水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）其主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。重组DNA技术，又称分子克隆（molecularcloning）或DNA克隆（DNAcloning）或基因工程（geneticengineering）技术expression思想基础：1.DNA重组在自然界中不断发生；DNA可在不同个体及物种中转移(~1964Holliday模型)2.DNA承载遗传信息(1944转化实验；1953双螺旋结构；中心法则)基本材料条件：质粒：(1952)酶：DNAligases(1967)，RE(1970)转化：CaCl2感受态制备(1972)首个重组DNA分子(1972)Sanger测序(1977)，PCR(1983)首个人工重组DNA分子重组DNA技术不断发展1977年美国博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造首家利用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1980-1990年转基因小鼠，基因敲除小鼠1986年英国科学家魏拉德森首次利用细胞核移植法克隆出一只羊2013年CRISPR/Cas9基因编辑技术中国在1982年已用基因工程方法培育出生产干扰素的大肠杆菌新菌种，它产生的干扰素跟天然干扰素一样具有抗病毒活性。刘兴汉教授博士生导师曾在中央电视台新闻联播等多家媒体报道。经定点诱变的基因重组内皮抑素在保持原有的抑制新生血管生成活性的基础上，增加了直接抑制肿瘤细胞生长和迁移的活性。体外抑瘤实验抗肿瘤活性增加了6倍，肿瘤细胞迁移抑制率提高了21个百分点；裸鼠体内抑瘤实验用药21天抑瘤率提高11个百分点。属源头创新，具有自主知识产权，已申请国家发明专利。目前有关肿瘤抑素和TAT-凋亡素的研究也已取得突破性进展。GeneticengineeringRecombinantDNATechnologyseemsomnipotent重组DNA技术无所不能ChanginginheritablecharacterChanginggeneticmaterial幽灵走上餐桌了吗——转基因食品目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）DNA克隆一、重组DNA技术中常用的工具酶限制性核酸内切酶※DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接；②缺口平移制作高比活探针；③DNA序列分析；④填补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列,并裂解磷酸二酯键。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ（基因工程技术中常用Ⅱ型）1970,HamiltonO.SmithisolatedandcharacterizedthefirsttypeIIrestrictionenzyme,HindII,fromthebacteriumHaemophilusinfluenzaeHindIIII型RE是重组DNA技术中常用的内切酶细菌如何保护自身DNA免受限制性内切酶切割？与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。I，III型RE均为复合功能酶，同时具有限制和DNA修饰作用。限制-修饰系统组成•限制性内切酶•甲基化酶作用构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识