第二章 柱、纸色谱(4h)

第二章柱色谱法和纸色谱法第一节柱上色谱法柱上色谱可分为:柱上吸附色谱法、柱上离子交换色谱法、柱上分配色谱法、柱上凝胶色谱法。。柱上色谱法是比较古老的（1903年，Tswett提出来）。由于此法分离效率低，速度慢，因之在五十年代以前为主要的分离技术，但五十年代后，由于其它色谱技术（薄层色谱、气相色谱）的出现，其应用受到很大限制。但是由于此种方法所用设备和操作方法都比较简单，可处理大量样品，在有机分析中，主要可用于有机样品的提纯（脱脂、脱色、脱胶、脱水），初步分离或制备纯样品等，因之该法仍然为人们所采用。此外，随着天然产物化学的发展，许多天然有机物的应用价值日益提高，而这些化合物往往又难于合成，因之从天然界提取就成了唯一来源，这就必须采用制备型柱色谱技术。故柱色谱也是植物化学工作的主要技术之一。1．柱上吸附色谱法原理：按照各组分在吸附剂上的吸附能力大小来分离的。吸附剂的选择（凭经验决定）：一种合适的吸附剂应该具备这样一些条件：（1）它能够可逆地吸附待层析的物质；（2）它不会引起被吸附物质的化学变化；（3）它的粒度大小应该能使显层剂以合适的速率流过；（4）吸附剂最好是白色的或浅色的，以便于对色层带进行观察；（5）颗粒具有一定的机械强度，操作时不易破碎；（6）不能与待分离物质及流动相产生化学反应，也不应相互溶解。一般弱极性溶质宜选用强极性吸附剂，而强极性溶质宜用弱极性吸附剂。最常用的吸附剂：氧化铝和硅胶。它们能符合上述要求，并且经过不同处理可以随意得到不同的活度。例如，氧化铝可以在不同温度烘干达到各种不同的活度。必须指出，活性大的吸附剂用于色谱法并不一定最合适，因为活性太大，物质被吸附得太牢，以致不易被洗脱下来。其他较常用的吸附剂有：氧化镁（用于吸附烃、醇、酮、醚及硝基物等），碳酸钙（用于吸附叶绿素）硫酸钙（用于吸附花色苷、维生素K1），氧化钙、氧化钛、碳酸钡、硫酸镁、无水碳酸钠（应用于吸附叶绿素），滑石粉（用于吸附有机酸、酚类、2,4-二硝基苯腙），硅藻土、蔗糖（用于吸附叶绿素）及淀粉等。许多吸附剂遇水即失去活性，这时只能用无水溶剂。实验技术吸附剂的粒度及用量：一般在80~300目间变动。粒度细，分离效果好，但速度太慢。吸附剂的用量，一般为样品的30~50倍，有时达100倍。色谱柱：很简单，只需要一支适当长度、适当口径的玻璃管，管下口做一紧缩处及一斜口，再连一个吸滤瓶即可。柱长与内径之比在10﹕1~4﹕1间较好。装柱方法有两种：干法装柱，将吸附剂由柱口装入，边装边轻敲打，以使吸附剂装填密实均匀。吸附剂装完后，把淋洗剂沿管壁轻轻加入，使之浸润吸附剂，淋洗剂加入后发现柱内有气泡时，可敲打柱体或施加适当压力以压缩气泡，使气泡随淋洗剂一起排出。湿法装柱，有两种操作方法：方法Ⅰ：先将柱体下端活塞拧死，向柱内加入一定高度之淋洗剂，然后将吸附剂自上端慢慢加入，淋洗剂的液面一定要高出吸附剂层。吸附剂加完后，打开活塞，放出淋洗剂，直至吸附剂层不在沉降为止。方法Ⅱ：将吸附剂用淋洗剂调成糊状，慢慢倒入柱中，在保证淋洗剂液面略高于吸附层条件下，让淋洗剂自柱中慢慢流出，直至吸附剂沉降不在变动为止。不论何种方法装柱，要求装好之柱体密实均匀，无气泡，在淋洗过程中无裂纹出现，一般湿法装柱比干法好。被分离样品的准备：柱色谱所用样品溶液一般配成较浓的溶液，最好为饱和液，这样样品加到柱顶集中，分离效果好，配制样品所用的溶剂极性要小，以利于样品立即被吸附剂吸附。如果样品在低级性的溶剂中溶解度很低，最好将样品用一合适的溶剂溶解，再与吸附剂相拌，低温烘干待上样。上样：样品溶液配好后可开始加样，方法为当柱内淋洗剂流至液面与吸附剂面相平时，将样品溶液沿管壁加入柱内，注意不要让样品溶液自由落下而打乱柱顶吸附剂层。当样品液面和吸附剂面相平时，用样品溶剂数滴沿管壁加入，以洗净管壁上的样品液，当液面与吸附剂面再次相平时，加入显层剂进行显层。如果是和吸附剂相拌的样品，将柱内淋洗剂不要流至与吸附剂面相平，要保持一定的淋洗剂高度，将样品粉末缓缓地加入，并轻轻敲击柱子使气泡充分地排除，加完样品后，让淋洗剂流至与吸附剂表面相平，用样品溶剂数滴沿管壁加入，以洗净管壁上的样品液，当液面与吸附剂面再次相平时，加入显层剂进行显层。显层:使样品各组分在柱内进行分离的过程叫显层，此过程中所用的溶剂叫显层剂。显层剂的选择:一般来说，显层剂的极性比样品极性小些。常用的显层剂有石油醚，二硫化碳，苯，四氯化碳，氯仿（代表弱极性显层剂），乙醚，异丙醚（中等显层剂），低分子量的醇、酮（强显层剂）等，一般可用单一种，也可用混合剂，一般先试之，最后确定出合适之显层剂来。显层方法：待柱上样品液面与吸附剂面相平后，加入显层剂，并始终保持显层剂面高出吸附剂面，待第一个组分估计由柱下端开始流出时，停止加显色剂，显层结束。注意：有机物自吸附剂上被洗提出来的先后次序一般是：饱和烃，烯烃，双烯烃，芳烃，醚，酯，酮，醇，二元醇及羧酸。色层的分离方法：（1）推出法：将吸附剂自吸附管中推出，用小刀将各色层带切开，分别用适当溶剂提取，滤去吸附剂，将滤液浓缩就可以得到各组分。当用这种办法分离时，吸附柱玻璃管不能用下口紧缩的，而必须是两头都开的。（2）洗提法：待显层后，用一种极性较强、吸附力较大的溶剂将各组分依次顶替下来，用几个接收器分别接收流出的各个组分。这一步骤常称为“洗提”。洗提用的溶剂称为洗提剂。将各分洗提液分别浓缩即得到各组分。无色物质层析时找出色层带的方法：①将吸附柱系统地切断，将各段逐一用溶液洗提，鉴定各洗提液中的物质。②连续地洗提吸附柱，分别用接收器接收一定量的洗提液，然后鉴定各洗提液中的物质。③层析完毕后，用显色剂显色。（常用的显色剂下表）。④用紫外光照射，使能发荧光的物质发生荧光。对于不发荧光的无色物质，可以用发荧光的吸附剂。就是在普通吸附剂中加入某种能在在紫外光照射下发荧光的无机物（如硫酸锌）或有机染料。该荧光染料不致降低吸附剂的活性，且在给定的吸附条件下又不会被洗提出来为宜。这时在柱上形成的色层带相应地改变了吸附剂原来的荧光的强度，借这种改变可以了解色层带的位置。常用的荧光染料如桑色素（morin）用于三氧化铝柱，小檗碱（berberine）用于硅胶柱，二苯基荧光吲啶磺酸（diphenylfluorin-dinesulfonesulfonicacid）及桑色素用于氧化镁或氢氧化钙柱。⑤制备有色衍生物，然后进行色谱分析。柱上层析常用的各种显色剂*化合物显色剂烯烃先用3mg藏红溶于25mL水的溶液处理，然后用0.1mol/LKI溶液（加有4~5滴）处理，藏红的原来颜色被漂白，但当含有不饱和烃、砜、二芳基胺或三芳基胺存在时，色层带上红色重新出现。醇类四个碳原子以上的醇可先用每升含200至300mg钒酸铵溶液处理，再用8-羟基喹啉溶于6%的乙酸所成的2.5%的溶液处理。色层带在暗绿色背景上显橙棕色。酚类1．香草醛溶于浓硫酸所成1%的溶液，色层带显淡红至红色。2．重氮盐溶液，色层带显黄至红色。醛与酮类用2,4-二硝基苯肼饱和的2mol/L溶液，色层带显黄色，醛用希夫试剂处理，显紫红色。胺1．四氯对醌在1,4-二氧六环中的饱和溶液是对脂肪胺的最好显色剂，在橙色背景上色层带显绿色。2．1%氟硼酸对硝基亚氮盐水溶液是检出芳胺色层带的很有效显色剂。色层带呈橙至红色，酚类也有同样反应。硫醇于7.5gNaOH在40mL水内所形成的溶液中加入1.25gPbO作为显色剂，如有黄色的色层带出现，表示有硫醇存在，这时如再用硫在苯中的饱和溶液处理，色层带即转变为灰色至黑色。硫醚以0.5gKI溶于25mL水中，再加入两滴2M氯化金溶液，作显色剂，硫醚色层带在粉红色背景上显棕至黑色，胺有同样反应，但胺的吸附力强，留在柱的上端，因此得与硫醚区别。芳环将10mL浓硫酸与0.2mL37%的甲醛溶液混合作显色剂，单环芳烃显红的色带。一般说来，双环或多环芳烃显绿色或蓝绿色色层带，此种溶液必须当天配制。*本表所列各显色剂是在以苯作为显层剂，以硅胶作为吸附剂的情况下使用的，本表中各试剂的百分浓度，均指重量百分比。2．柱上离子交换色谱法1）离子交换树脂柱上离子交换色谱主要用来除去样品中微量电介质杂质。其装置与柱上吸附色谱相同。固定相为离子交换树脂。离子交换树脂的种类很多，但可分为两大类型：阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。均为高分子化合物。阳离子交换树脂一般为Na型（高分子钠盐）。使用前要用稀盐酸浸泡处理为H型，然后进行交换，以磺化交联聚苯乙烯为例，再生和交换原理如下表示：此外还有交联丙烯酸盐或磷酸盐等阳离子交换树脂。CHCH2CH2CHCHCHCH2CH2SO3-Na+Mg++Ca++固定相+HCl再生交换液相CHCH2CH2CHCHCHCH2CH2SO3H+Mg++Na+Ca++固定相液相阴离子交换树脂一般为高分子的氯化季铵盐化合物，称Cl型，使用前要用稀碱处理为OH型，然后交换，以交联聚苯乙烯氯化季铵盐为例，其再生和交换如下：此外，其它类型阴离子交换树脂还有交联丙烯酸仲铵型、叔铵型或季铵型。液相SO42-Cl-Ac-+液相固定相CH2N+(CH3)3OH-CHCH2交换再生NaOH+固定相SO42-Ac-CH2N+(CH3)3Cl-CHCH22）装柱：取一支400mm×10mm滴定管，下端放少许玻璃棉，关闭活塞，将处理好的树脂倒入至150~200mm高度即可。由于每种树脂都有一定的交换能力，一般每毫克干树脂约可交换1~9mmol离子，但一般操作中，只需交换二分之一最大量即可。据此就可算出树脂的用量及柱体的大小。3）交换：将待测样品液由装好的柱上部倒入，由柱下部放出，或由下部加入而由上部排出。但流速应以待处理溶液在柱内有一定停留时间为准。4）洗提：样品液处理完后，用另一种电解质通入柱内，将已交换于柱上的离子用新的离子顶替出来，从而达到分离或提取目的。5）再生：再生是树脂恢复为H型或OH型的操作，此步可与洗提为同步，也可不同步，不同步时，即用酸或碱浸泡树脂即可。6）举例：A糖中除酸（葡萄糖中除去柠檬酸）向阴离子交换柱中通入糖液，则柠檬酸负离子被交换于树脂上，排出糖液，则达到分离目的。树脂用碳酸铵液洗提，则得柠檬酸铵溶液。然后树脂再用NaOH液再生。B除去羰基化合物——异丙醇中除去少量丙酮。向阴离子交换柱中加入亚硫酸氢钠液，则亚硫酸氢根负离子交换于树脂上，用水洗至无碱性，然后通入异丙醇丙酮样品，则丙酮与交换于柱上之亚硫酸氢根负离子加成而留于树脂上，而余下之异丙醇则流出，从而达到分离目的。然后向柱中再通入稀NaCl液，则氯离子顶替出亚硫酸氢钠和丙酮，完成洗涤任务，最后树脂再于碱液中再生。离子交换色谱交换物质量很小，只适于半微量样品中微量杂质的除去。另外一般要求样品为水溶液时才好交换，而且交换下来的洗提液都很稀，组分回收困难，故对于样品已处于很稀溶液时而且再无更好分离方法时才用此法。除了上述吸附柱色谱和离子交换柱色谱外，还有凝胶柱色谱和分配柱色谱。纸上色谱法是分配色谱法中较常用的。最简单操作之一是取一条滤纸，悬挂在一个支架上，使它的底端浸入一盛有溶剂的浅皿中。在纸下端刚好高出液面部分用毛细管滴上一滴试液。将支架置于密闭容器内，使纸周围为溶剂蒸汽所饱和，静置数小时，在这期间，溶剂由于纸上毛细管作用而沿滤纸上升。当溶剂前沿升到快近纸条上端时，取下滤纸使之干燥。如果试液中的化合物是有颜色的，则纸上会显出各组分斑点。较常见的情况是，层析的化合物是无色的，那么，待纸干燥后，于纸上喷以显色剂而使化合物斑点显色。上法为上行纸上色谱法。第二节纸上色谱法同理也有下行纸上色谱法。上行法一般需时间较多，但溶质在两相中的分配较易达到平衡。所以产生的斑点面积紧凑园整。组分易于分开。下行法快，省时间，对易分离化合物最好采用下行法。此外也可采用双向纸上色谱法。纸上色谱法的Rf值，通常要受到下列因素的影响：（1）纸的质量；（2）温度；（3）化合物取量；（4）溶剂；（5）试样原点与溶