热原检查法

第三节热原检查法热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的尸体及其代谢产物。大多数微生物都能产生热原，致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。它的化学结构是脂多糖和微量蛋白的复合物热原的定义热原与细菌内毒素的区别热原物质包括了细菌内毒素，细菌内毒素是众多热原物质中的一种，也是最主要的一种。一般来说内毒素是热原,但热原不仅仅包括内毒素。不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性。在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。热原除具有很强的致热性外，还具有下列性质：耐热性：180℃2小时以上或250℃30min以上才能彻底破坏热原。因此，玻璃制品如生产过程中所用的容器和注射时使用的注射器等，均可用高温破坏热原。水溶性：热原能溶于水，可用大量无热原注射用水冲洗以除去热原。不挥发性：热原本身不挥发，但可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水中，故用蒸馏法制备注射用水时，蒸馏水器应有隔离装置。滤过性：热原体积极小,直径1~50nm,可通过普通滤器进入滤液中。不耐强酸、强碱、强氧化剂：热原能被盐酸、硫酸、氢氧化钠、高锰酸钾、重铬酸钾等所破坏。热源的性质热原反应：热原进入机体后的数分钟至1小时内,突然发冷、寒战、面色苍白、四肢冰冷、烦躁不安等症状。持续时间约0.5~1小时。寒战消失后,随即高热,但也有无寒战期而突然高热者。病人体温迅速上升,在2~4小时体温上升至高峰,一般在39~40℃,严重者高达41℃以上,病人面色潮红、头痛、恶心、呕吐。严重者瞻妄、昏迷,甚至死亡。热原的危害热原检查法的定义本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定试验用的注射器、针头及一切和供试品溶液接触的耐高温器皿,应置烘箱中用250℃加热30分钟（英国药典200℃1h）不耐高温器皿可置于30％双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗，60℃烘干备用实验耗材去热原实验动物的选择—体重性别条件饲养温度试验温度中国药典＞1.7kg不限，雌兔应无孕使用7天预养期未见异常的未试动物，或已试的符合热原规定的动物。不使用3天内已试动物，不使用热原试验不合格的动物。17-25℃变化≤3℃美国药典≥2.0kg不限，雌兔应无孕20-23℃选定温度±3℃英国药典≥1.5kg不限，雌兔应无孕20-23℃变化≤3℃—时间给药测量次数选择条件中国药典3-7天N8次30min/次8次体温均在38.0-39.6℃之间，且最高与最低体温相差≤0.4℃，个体间体温差≤1℃美国药典7天内N8次30min/次体温不超过39.8℃，个体间体温差≤1℃英国药典1-3天10ml/kg生理盐水（38.5℃）10次30min/次，舍去前2次体温在38.0-39.8℃之间，个体间体温差≤1℃1.抓取兔子的正确方法：一手抓持兔颈背部皮毛，一手托起兔臀部。2.在热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于3℃，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3℃。3.应避免噪音干扰。4.整个试验操作过程应尽量轻柔，避免激惹动物，造成体温大幅波动，影响结果。5.家兔在试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。6.读取体温：一手拿住体温计尾部，使眼与体温计保持同一水平，然后慢慢地转动体温计，从正面看到水银柱时就可读出相应的温度值，切记不可用手碰触水银球端7.静脉给药前需将供试品温热至38℃（美国药典37±2℃，英国药典38.5℃），注射要缓慢。注意事项1.试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中，使其适应试验环境，饲养温度与环境温度相差≤±3℃。2.每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次（英国药典测4次，但前2次舍去），两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1℃。两次体温的平均值作为兔的正常体温。2、测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量（10ml/kg）并温热至约38℃的供试品溶液.3.每隔30min按前法测量其体温1次,共测6次。4.以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数，当动物升温为负值时，以0℃计算。初试初试结果判断:合格复试不合格中国药典三只动物体温升高均低于0.6℃，且三只动物体温升高总和低于1.3℃三只动物出现体温升高高于0.6℃，或者三只动物体温升高总和高于1.3℃体温升高≥0.6℃的动物数量超过1只美国药典三只动物体温升高均低于0.5℃三只动物出现体温升高数高于0.5℃—英国药典3只体温升高总和≤1.15℃1.15℃＜3只体温升高总和≤2.65℃2.80℃＜6只体温升高总和≤4.30℃4.45℃＜9只体温升高总和≤5.95℃3只体温升高总和＞2.65℃复试及结果判断:•实验步骤合格不合格中国药典另取5只动物进行复试，试验方法同初试复试5只动物中体温升高≥0.6℃的动物数不超过1只，合并初试三只动物，体温升高总和≤3.5℃复试5只动物中体温升高＞0.6℃的动物超过1只；或合并初始、复试8只动物体温升高总和＞3.5℃美国药典另取5只动物进行复试，试验方法初试合并初试、复试8只动物，体温升高超过0.5℃的动物数≤3只，或者超过3只，但体温升高总数≤3.3℃合并初试、复试8只动物，体温升高超过0.5℃的动物数＞3只，体温升高总数＞3.3℃英国药典加试3只动物，最多加试三组，合并初试共12只动物6只体温升高总和≤2.80℃9只体温升高总和≤4.45℃12只体温升高总和≤6.60℃6只体温升高总和＞4.30℃9只体温升高总和＞5.95℃12只体温升高总和＞6.60℃传统热原检测方法的不足内毒素法：家兔法：费用高结果重复性差使用活体动物实验只能检测细菌内毒素鲎（hòu）资源日益匮乏鲎（hòu）亦称马蹄蟹。肢口纲（Merostomata）剑尾目（Xiphosura）海生节肢动物，共4种，见于亚洲和北美东海岸。虽又称马蹄蟹，但不是蟹，而与蝎、蜘蛛以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系。鲎(horseshoecrab)是一类与三叶虫（现在只有化石）一样古老的动物。鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌,所以鲎有“活化石”之称。蓝血的活化石--鲎鲎具有很高的药用价值,，它的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。科学家也使用鲎血研究癌症。但是，对鲎抽血后，它们就被放生随着各种新技术产品的出现及现有方法存在的问题，传统热原检测方法日趋落后，不适应于产品的热原检测。外热原人体（分泌内热原）体温调节中枢发热新方法主要以应用动物来源或人源细胞模拟人体，通过检测内源性热原（主要为细胞因子，如IL-6、IL-1、TNF-α）在体外进行热原检测。新方法原理细胞（分泌内热原）国外对新方法的研究始于20世纪80年代，国际发达国家实验室，包括英国国家生物制品检定所NIBSC、德国国家疫苗及血清研究所PEI等，均对新的体外热原检测替代方法开展了研究。新方法国外研究现状2010版欧洲药典已收录了5种新体外热原检测方法：①人新鲜全血—IL-1β法②人新鲜全血—IL-6法③人冻存全血—IL-1β法④MM6细胞—IL-6法⑤PBMC细胞—IL-6法①不使用动物进行体内实验②能真实地模拟人体对热原的反应③能检测非内毒素热原④能定量或半定量⑤能被广泛地应用⑥操作简单可行新方法优点新方法国内研究现状国内对新方法的研究与国际相比有一定差距，2010版中国药典未收录新热原检测方法。国家药典委员会已经启动了体外热原检查法的课题.兔新鲜全血法鼠新鲜全血法人新鲜全血法人冻存全血法PBMC细胞法已开展的研究方法感谢聆听！时间：2017年4月第三组：王雅静、吴显婷、郭帅、祁宇