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MTT法检测细胞活力细胞毒性检测细胞形态学观察细胞生长状态观察细胞活性检测MTT法目的和意义检测细胞存活和生长情况用于评价药物产生的细胞毒作用原理•四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT•活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。•在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。活细胞+MTT琥珀酸脱氢酶紫蓝色结晶物Formazan贴壁细胞操作步骤1.接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000-6000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积50ul。（边缘孔用空白培养基填充）。2.培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药50ul，一般设3个复孔。3.5%CO2，37℃孵育20小时，倒置显微镜下观察。4.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞操作步骤：•1）调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培养液稀释lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照。•2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。•3）每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后直接测），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）•4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。•5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。药物的配制•浓度•体积•过滤MTT的配制•MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。•MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。•配制MTT时用PBSph=7.4溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。实验结果统计学处理•所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50（半数抑制浓度）。或计算抑制率。OD对照组-OD实验组•细胞死亡率%=OD对照组×100%注意事项1．选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2．设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。实验前应明确的问题•1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3.时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。关于细胞的接种(铺板)•细胞过了30代以后就不要用了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。•接种时最好按照预实验摸索出的密度接种,且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。•细胞密度要根据不同细胞的特点来定。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104。•MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。•注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。如何清除上清•直接吸出：加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)。•翻转倒扣法：可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3次，比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，但前提是细胞贴壁要比较牢。加入DMSO•在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.•加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min,时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信.•加入DMSO溶解后尽快检测。OD值的测定•至于测定波长的选择是因显色溶液而异的。对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值。•DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而ＳＤＳ做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变。•细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。材料（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4℃）5.倒置相差显微镜6.CO2培养箱7.振荡混合仪8.酶联免疫检测仪9.移液枪10.电磁力搅拌机11.微孔滤器（二）玻璃器皿1.吸管2.小烧杯（100ml）3.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.96孔培养板4.15ml离心管5.10ml离心管6.胶塞（四）其他物品1.微量加样枪2.红血球计数板（五）试剂1.含血清的培养基.2.0.08%胰酶3.二甲基亚砜（DMSO）4.MTT溶液•细胞数目6000×100=6×105•细胞体积200ul×100=20ml•细胞密度0.3×105•药物浓度2001005025•药物体积15×100ul=1.5ml半倍稀释人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。