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免疫系统第二十二章免疫学检测一、目的要求（一）掌握抗原抗体反应的原理；凝集反应、沉淀反应与免疫标记技术的原理和应用。（二）熟悉淋巴细胞的分离与类型鉴定的方法；T细胞功能测定的方法。（三）了解B细胞功能测定；吞噬细胞功能测定。二、教学内容（一）抗原抗体检测的原理及方法（二）免疫细胞的检测（三）免疫学检测方法的应用实验课内容毒素—抗毒素的中和试验、中和实验结果观察及免疫器官观察凝集反应沉淀反应E花环形成实验淋巴细胞转化试验中性粒细胞吞噬功能实验酶联免疫吸附实验（ELISA）第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serologicalreaction)应用：•用已知抗原检测未知抗体；•用已知抗体检测未知抗原：•定性或定量检测体内各种分子；•用已知抗体检测半抗原物质。（一）特异性和交叉反应特异性：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性。一、抗原-抗体反应的特点交叉反应（crossreaction）性：若两种抗原分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生反应。结合价：天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为多价。单体形式的抗体分子有两个Fab段，能结合两个相同的抗原决定基，为两价。前带现象（prozone）和后带现象(postzone)Ab过剩和Ag过剩（二）抗原-抗体结合的带现象与可见性前带现象（prozone）和后带现象(postzone)Ab过剩和Ag过剩比例合适：若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个Fab段分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成网格状复合体，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。抗原-抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但可逆。在一定条件下（如低pH、高浓度盐、冻融等），抗原-抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。（三）可逆性（一）电解质抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体。二、抗原-抗体反应的影响因素（二）酸碱度抗原抗体反应的最适pH是6-8。（三）温度最适温度为37℃。有些例外，如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。（四）抗原和抗体的性质抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原-抗体反应。抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定基之间的结合能力亲和力(affinity)Avidity•TheoverallstrengthofbindingbetweenanAgwithmanydeterminantsandmultivalentAbsKeq=104Affinity106Avidity1010Avidity一个抗体分子与整个抗原分子间的结合强度亲合力(avidity)根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类：（一）凝集反应（二）沉淀反应（三）补体参加的反应（四）免疫标记技术第二节检测抗原和抗体的体外实验颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应(agglutination)。（一）凝集反应（AgglutinationTests）1．直接凝集（directagglutination)：细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。2．间接凝集（indirectorpassiveagglutination)：检测针对可溶性Ag的Ab3．间接凝集抑制试验(directagglutinationinhibitiontest)4.协同凝集试验（co-agglutinationtest）直接凝集反应直接凝集反应(directagglutination)：颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。参与反应的抗原称为凝集原，相应的抗体称为凝集素。试管凝集试验间接凝集反应间接凝集反应(indirectagglutination):将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象.载体可溶性抗原致敏致敏颗粒凝集颗粒间接凝集抑制试验（妊娠试验）应用：可用于检测抗原或抗体（如早孕的检测），其灵敏度高于一般间接凝集试验。间接凝集抑制试验免疫妊娠试验（1）免疫妊娠试验（2）各种凝集反应示意图Ag-Ab反应的基本检测方法（一）凝集反应（二）沉淀反应（三）补体参加的反应（四）免疫标记技术Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。（二）沉淀反应（PrecipitationTests）1．单向免疫扩散(singleimmunodiffusion)2．双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)3．免疫电泳(immunoelectrophoresis)4．免疫比浊(immunonephelometry)（二）沉淀反应单向免疫扩散(singleimmunodiffusion)双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)单扩与双扩原理Ag-Ab反应的基本检测方法（一）凝集反应（二）沉淀反应（三）补体参加的反应（四）免疫标记技术用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。（四）免疫标记技术（Immunolabellingtechnique）此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。1．免疫荧光法(immunofluorescence,IF)（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。免疫荧光法分类免疫荧光法图示MousekidneysectionLaminin-green-fluorescentQdot®565IgGCD31-red-fluorescentQdot®655IgGNuclei-blue-fluorescentHoechst33342ControlTSLPTSLP-AlexaFluor®488Nuclei-propidiumiodideHASMC此法将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（OD）值可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。常见的标记物为：辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）２．酶免疫测定(enzymeimmunoassay,EIA)常用的方法如下：（1）酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)（2）免疫细胞或组织化学（immunocytochemistryorimmunohistochemistry,ICCorIHC)1）ELISA是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。双抗体夹心法：用于检测特异性抗原。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。间接法：用于检测特异性抗体。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。ELISA分类间接法图示ELISA反应过程动画演示2)酶联免疫斑点试验(ELISPOT)生物素（biotin）是广泛分布于动、植物体内的一种生长因子，又称辅酶R或维生素H。亲和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一种蛋白质，由4个亚单位组成。生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。3）BAS（biotinavidinsystem)-ELISA：BAS-ELISA应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。4）免疫细胞或免疫组化技术ICCIHC乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等。3．放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)４．化学发光免疫分析将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。该法又称Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原。５．免疫印迹法(immunoblotting)免疫印迹法第三节免疫细胞的检测一、淋巴细胞及亚群的分离外周血单个核细胞(PBMC)的分离：葡聚糖－泛影葡胺（即淋巴细胞分离液）密度梯度离心法淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及功能差异而分为不同的群和亚群。1．尼龙棉分离法2．E花环分离法3．洗淘法4．流式细胞术(flowcytometry，FCM)5．磁珠分离技术E花环实验磁珠分选RemovalofTcellsfrommarrowgraftMagnetMagneticantibodies二、免疫细胞功能的测定1.T细胞功能测定：(1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等；淋巴细胞增殖实验(2)T细胞介导的细胞毒试验：CTL(1)B细胞增殖(转化)试验(2)溶血空斑形成试验(3)酶联免疫斑点法(ELISPOT):2.B细胞功能判定溶血空斑实验第四节免疫分子的检测①在体外用已知抗原检测相应抗体：见前述②用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定：检测血清含量高的IgG、IgA和IgM时，可用免疫比浊法；检测IgD和IgE选用ELISA、RIA等灵敏度高的方法。诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法。一、免疫球蛋白的测定了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断。对血清含量高的C3、C4、B因子等，可用免疫比浊法，其他含量低的成分则借助ELISA、RIA等方法。血清总补体活性测定常采用50%补体溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作为抗原抗体复合物，通过经典途径激活待检血清中的补体，导致SRBC溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，则影响溶血