SSR分析的原理及操作技术

SSR分析的原理及操作技术DNA分子标记技术类型以Southern杂交为基础的分子标记技术：限制性内切酶片段长度多态性标记（RFLP）以PCR为基础的分子标记技术：随机引物PCR标记和特异引物PCR标记随机扩增多态性DNA（RAPD）扩增的限制性内切酶片段长度多态性（AFLP）相关序列扩增多态性（SRAP）简单重复序列（SSR）或简单序列长度多态性（SSLP）以mRNA为基础的分子标记技术：差异显示（DD）逆转录PCR（RT－PCR）以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术：单核苷酸多态性（SNP）SSR简介在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可分为：串联重复序列（Tandemlyrepeatedsequences）分散重复序列（Interspersedrepeatedsequences）依据重复基序的长度、拷贝数和位置等又将串联重复序列分为：卫星DNA：基序（motif）长10～300bp，甚至长1,000～100,000bp；小卫星DNA：基序长10～60bp；微卫星DNA：基序长1～6bp，其功能：重组热点、对基因的调节和表达以及性别决定等。SSR简介微卫星DNA即简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR），或者微卫星序列（microsatellite，MS），又称短串联重复（shorttandemrepeats，STR），是一类由几个核苷酸（多为2～4个）为基本单位多次串联重复而形成的DNA片段，其长度一般较短，多在200bp以内。微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大，但（AT）n最多。SSR标记的基本原理尽管微卫星DNA分布于整个基因组中的不同位置，但某一特定的微卫星的两端侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，将重复序列及其两侧的DNA片段进行克隆和测序，然后根据两端的侧翼序列设计一对特异引物，通过PCR技术将目的微卫星DNA片段扩增出来。SSR标记的基本原理由于单个微卫星位点的重复单元在数量上的不同，导致扩增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种多态性称为简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymorphism，SSLP)，每一扩增位点就代表了该位点的一对等位基因。SSR标记的多态性主要依赖于基本单位重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的，因此，SSR具有大量的等位差异，多态性十分丰富。PCR技术的基本原理聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。特点一：使特定的DNA片段得到了迅速大量的扩增，理论上的最高值达2n-2；特点二：能够指导特定DNA片段的合成。如何实现？PCR反应体系一对特异引物：1.引物长度：典型的引物长度为18-24bp，引物需要足够长，保证序列独特性。但是长度大于24bp的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量；2.引物浓度：一般0.1-0.5mol/L，过高的引物浓度会加剧错配发生，特异性下降；3.合理的G/C含量：一般为40％～60％。PCR反应体系Mg2＋溶液：其浓度直接影响引物退火的特异性、产物特异性以及酶的催化能力和准确性等，适当降低Mg2＋浓度可增加特异性。模板DNA：一般1ng/1µL，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加；dNTP：常用浓度为50-200mol/L，种dNTP浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。Taq酶：DNA聚合酶，热稳定，最适温度72℃，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。10×buffer缓冲液（不含Mg2＋）：维持PCRpH的稳定。PCR循环条件高温变性：双链DNA模板加热变性成单链；低温退火：在低温下引物与单链DNA互补配对；退火温度针对不同的引物差别较大，退火温度过低，极易形成非特异扩增，而退火温度过高，又难以扩增出条带，对于长度为20bp，GC含量为50％的核苷酸的典型引物，55℃是比较适宜的退火温度。适温延伸：在适宜温度下TaqDNA酶催化引物沿着模板DNA延伸。PCR条件优化优化引物设计：这是最关键的，可以借助计算机来辅助设计引物。热启动技术：在PCR反应的第一个循环中待温度升高且超过模板Tm值（80℃）后，再加入关键试剂如TaqDNA聚合酶等。这样操作可以减少非特异性扩增。创造一个有利于增加特异性扩增的条件：如降低Mg2＋，dNTP浓度，优化pH及减少Taq酶的用量，减少循环中各部分的时间或循环数，提高退火温度等。电泳原理在生理条件下，核酸分子之糖－磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。当核酸分子被放置在电场中时，他们就会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率较快。电泳介质琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶优点：①分辨率极高，可分开长度仅相差0.1％的DNA分子，即1000bp中相差1bp；②从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可用于要求最高的实验。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N,N,N,N’一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，聚合形成线状长链，在交联剂如N,N-甲叉双丙烯酰胺参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接而形成三维带状网络结构的凝胶。这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链DNA片断的分离与纯化。这些凝胶在尿素或甲酰胺等抑制核酸碱基配对的试剂的存在下发生聚合。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链DNA片段的分离和纯化。双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁移率也受其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条DNA的迁移率可相差10％。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高纯度的DNA片段和检测蛋白质－DNA复合物。用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时，通常PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离效果优于非变性胶。因为杂合个体在PCR后期的循环中会产生异源双链分子，导致在杂合的情况下胶中产生了3条带甚至是4条带，而不是正常的2条带。这种情况出现会干扰等位基因的统计。染色方法与原理溴化乙锭（EB）染色法：但是聚丙烯酰胺对荧光燃料溴化乙锭的荧光有猝灭作用，EB染色法很难检测到少于10ng的DNA条带。银染法（硝酸银）：是一种检测微量DNA的理想方法。优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永久保存原理：银染液中的银离子(Ag+)可与DNA形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛在碱性条件下使Ag+还原成银颗粒，可把DNA电泳带染色成黑褐色载样缓冲液（loadingbuffer）指示剂（溴酚蓝或二甲苯氰）一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400等组成载样缓冲液，加入到扩增好的PCR产物当中。作用：1.增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。2.形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。3.使样品呈色，使加样操作更方便。实验方法与步骤1.实验材料马贵荔（母本）×焦核三月红（父本）F1杂种群体中部分个体的基因组DNA溶液。每人做4个模板。一对特异引物：B-F09F：5’TCTGCTTACCAGCATGAGTGA3’B-F09R：5’CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG3’2.配制SSR扩增的反应液：各组份的用量及终浓度如下表，做多个反应时，可将所用的的相同组份一次取样、混匀后再分装至各个反应中。组分1个反应体积终浓度4个反应体积ddH2O10.2µL40.8µL10×buffer缓冲液（含15mMMg＋）2.0µL1×8µL2.5mMdNTP1.6µL0.2mM6.4µL5µM引物F1.0µL0.25µM4µL5µM引物R1.0µL0.25µM4µL模板DNA（5ng/µL）4µL1ng/µLTaq酶（5U/µL）0.2µL1U0.8µL总体积20µL80µL3.SSR-PCR配制好反应液后，放入PCR仪中进行扩增反应，扩增程序为：94℃3min（预变性）；94℃50s→55℃50s→72℃50s（35个循环）；72℃10min（延伸反应）4.制备5％的变性聚丙烯酰胺凝胶：将长、短玻璃板固定在制胶板上，用1.0％的琼脂糖封口，将配好的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳子，静置1h，让其聚合凝固。5％变性胶100ml尿素（Urea）42g5×TBEbuffer20ml40％丙稀酰胺12.5ml10％过硫酸铵400µlTEMED87.5µl40％丙稀酰胺溶液（19：1）100ml丙稀酰胺（Acrylamide）38g甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide）2g5.电泳样品的准备：在PCR产物中加入8µL的loadingbuffer混合，得到混合物，95℃加热3min，迅速置于冰上冷却，然后点样。6.电泳：每个点样孔中，点加适量的混合物（4µL），每排梳孔中最左边的梳孔用于点加DNAMarker（分子量标记物），以便计算分子量，以300V电压进行恒压电泳，电泳液为0.5×TBE，待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳。Loadingbuffer组分用量98％Formamide（甲酰胺）49ml（100％）10MmEDTA（pH8.0）1ml（0.5M，pH8.0）0.25％BromophenolBlue（溴酚蓝）0.125g7.染色步骤试剂漂洗30sddH2O染色8min0.1％硝酸银400ml漂洗30sddH2O显色4min8gNaOH，2ml37％甲醛，0.1g四硼酸钠定容至500ml漂洗ddH2O8.观察记录父母本及F1代的带型，供进一步的分析用。