03物理图谱与测序

第三章DNA物理图谱的构建及序列测定物理图谱（physicalmap）物理图/限制性图谱（restrictionmap）是各种限制性内切酶切点在某一DNA分子或DNA片段上的排列，由于各酶切点之间的距离是以碱基对（kbp→mbp）表示的，所以可计算出二切点间的绝对距离，因此限制图也称物理图。物理图谱的构建是基因组研究的重要组成部分。质粒pBR322的限制图一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）细菌核酸内切酶识别、剪切特殊双链DNA序列用途：DNA物理图谱构建、DNA序列分析、基因分离、基因定位、DNA重组1.细菌的修饰作用和限制性核酸内切酶的发现20世纪50年代，Luria&Human、Bertani&Weigle：噬菌体→细菌菌株1，正常生长。→细菌菌株2，生长受到强烈抑制；少数存活，再次感染菌株2，正常生长——受到宿主的特意修饰。机制？《老虎机与破碎的试管》LuriaE.coli菌株λ噬菌体感染率KBCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC11111寄主控制的专一性（hostcontrolledspecificity）几乎所有研究噬菌体的科学家都将之视为一种有趣但似乎没有什么意义的现象而忽略了。1962，Arber（瑞士）：宿主的修饰在噬菌体DNA上进行1965，Arber：宿主所致的限制现象中伴随有噬箘体DNA的大量降解，——宿主对入侵噬菌体的修饰与噬菌体DNA降解密切相关；预言细菌中存在位点特异性限制酶；修饰是宿主甲基化酶作用结果：建立细菌限制-修饰（R-M）系统概念如何分离酶？Arber假说细菌中存在具有相同位点特异性的2种酶：限制性内切核酸酶；甲基化酶——细菌利用限制酶特异性识别、降解噬菌体DNA；细菌自身DNA分子通过甲基化修饰酶进行甲基化修饰保护，阻止限制酶的作用。细菌的限制-修饰系统是抵御外来侵袭的一种重要措施1978年诺贝尔生理学或医学奖限制性核酸内切酶的发现1968年，Linn&Arber于大肠杆菌B中发现第一种限制性内切核酸酶（I型：识别特异剪切随机）。1968年，Meselson&Yuan从大肠杆菌K中获得高纯度限制性内切核酸酶（I型）。识别DNA序列上特定的位点，但其切断DNA分子时，却具有很大的随机性；兼具修饰功能，活性依赖一种小分子——S-腺苷甲硫氨酸Meselson错失诺贝尔奖1970年，研究有关流感嗜血杆菌的遗传重组问题，噬菌体P22的DNA加入到嗜血杆菌的提取液中，DNA消失了——Smith从流感嗜血杆菌Rd中分离出第一种II型限制性内切核酸酶——HindII。与Arber共享1978年诺贝尔生理学或医学•流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，→HindⅡ限制性内切酶。HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下：5'…GTPy↓PuAC…3'3'…CAPu↑PyTG…5'上世纪80年代，限制性内切酶开始克隆表达限制-修饰系统Smith等的工作流感嗜血杆菌Rd与其它细菌相似DNA甲基化程度低：m5C，N6-mA；但存在甲基化酶细胞粗提物→磷酸纤维素层析→蛋白；*S-腺苷甲硫氨酸转移甲基→鱼精DNA/T7DNA。——检测出4种腺嘌呤甲基化酶其中一种处理T7DNA→免受HindII裂解；先用HindII处理鱼精DNA→对应甲基化位点破坏。——限制性内切酶-修饰性甲基化酶共识别位点限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。磷酸纤维素层析——阳离子交换层析氨基酸的等点点（isoelectricpoint，pI）在一定的pH条件下，氨基酸分子中所带的正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点(isoelectricpoint,pI)。氨基酸在等电点时溶解度最小。H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+++H++OH-+H++OH-H2NCHCOOR-正离子pHpI两性离子pH=pI负离子pHpI离子交换层析分离蛋白质甲基转移酶催化甲基化（methylation）甲基供体：S-腺苷甲硫氨酸甲基受体：被修饰碱基（A、C多于G、T）碱基的甲基化修饰不是随机的，而是限于一定的顺序或DNA的某一区域，在甲基化酶的作用下进行，甲基化是可逆的。甲基化的意义：帮助细胞识别和区分自身DNA和外来DNA；调节基因表达；帮助DNA修复等。腺苷转移酶PPi+Pi+甲硫氨酸ATPS-腺苷甲硫氨酸(S-腺苷Met，SAM)S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶RHR—CH3腺苷SAMS—腺苷同型半胱氨酸同型半胱氨酸SAM为体内甲基的直接供体H2O腺苷或胞嘧啶的甲基化是多种细菌的限制修饰系统的一部份真核生物中也存在广泛的DNA甲基化修饰现象哺乳动物DNA的甲基化修饰和X染色体失活、胚胎发育、组织分化乃至癌症密切相关。真核生物，修饰则影响基因表达。大多数情况下，甲基化修饰导致基因表达沉默。并且这种修饰在细胞有丝分裂时可以代代传递。新的遗传学分枝--表观遗传学获得表型甲基化沉默基因基因功能对生长抑制信号不敏感P16CDKN2A抑制CDKRARβ14—3—3σ自身产生生长信号RASSFlA调控RAS信号途径逃避凋亡Capase—8起始凋亡TMSl促凋亡DAP激酶促凋亡P14AFR促凋亡无限增殖Rb抑癌基因维持血管生成血小板反应蛋白1(thrombospondin1)抑制血管生成VHL增加侵袭和转移能力E—钙粘连蛋白抑制转移TIMP3抑制转移基因组不稳定hMLHlDNA错配修复MGMT修复烷化鸟嘌呤BRCAl修复DNA损丧2.限制性内切酶的种类与特性限制性内切酶形式多样大小：PvuII（157个氨基酸）；CjeI（1250个氨基酸）。纯化分类的3000余种限制性内切酶，超过250种特异识别序列。研发工作仍在继续：分析细胞提取物，计算机分析已知基因组数据。同裂酶（识别序列与已有的重复）；新识别位点传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。I型限制性内切酶兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体(3x105-4x105Da)，需Mg2+、ATP、SAM。在识别位点很远的地方任意切割DNA链：EcoB识别位点——TGA*(N)8TGCT；EcoK识别位点——AAºC(N)6GTGC（A为可能的甲基化位点，N表示任意碱基）。切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性。不产生确定的限制片段，不具备实用性。II型限制性内切酶种类多（2x104-10x104），需Mg2+激活绝大多数Ⅱ酶识别序列/切割位点由4～8个核苷酸多以同二聚体结合于DNA，识别对称序列；极少作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续序列（EcoRI：GAATTC）；另一些识别不连续序列（BglI：GCCNNNNNGGC）。切割后产生一个3’羟基端和一个5’磷酸基团。相应的修饰酶需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。IIS型限制性内切酶Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内（如FokI和AlwI）。III型限制性内切酶兼有限制-修饰两种功能，需Mg2+、ATP；当ATP、SAM同在时，DNA分解与甲基化同时进行识别位点之外切开DNA链：EcoP1和EcoP15识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点则在下游24-26bp处。很少能产生完全切割的片段，不具备实用价值。3.识别位点的序列测定1970年，Smith建立：碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase）T4多聚核苷酸激酶（T4PolynucleotideKinase）胰腺脱氧核糖核酸酶（DNaseI）蛇毒磷酸二酯酶（snakevenomphosphodiesterase）电泳碱性磷酸酶T4多聚核苷酸激酶•T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将ATP的g-磷酸基转移至DNA或RNA的5'末端。牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseI）PPPPPPPP嘧啶嘌呤嘧啶嘌呤蛇毒磷酸二酯酶基本过程限制酶裂解33P-T7DNA32P标记5’端（碱性磷酸酶，T4激酶）DNaseI消化电泳分离双标记片段蛇毒磷酸二酯酶水解核苷酸鉴定4.影响限制性内切酶活性的因素*DNA纯度DNA制备过程中的污染：蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸钠）、高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。对策：①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多。②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。③延长酶催化反应的保温时间。内切酶活力单位1U定义为37℃、1h内完全分解1μgλ-DNA所需的酶量。理论用量：1μgλ-DNA只需1U酶作用1h；实际用量：2U，2h样品含酶抑制剂，重新纯化限量用酶——非特异性核酸酶活性Dnase的污染（活性需Mg2+，DNA储存缓冲液含EDTA）*DNA甲基化程度从大肠杆菌中分离的质粒DNA通常混有：dam甲基化酶，G*ATC；dcm甲基化酶，C*CA/TGG基因克隆中使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA，避免被核酸内切限制酶局部消化，甚至完全不被消化。核酸内切限制酶不切割甲基化的核苷酸序列的应用：甲基化酶的识别序列同某些限制酶的识别序列相邻，抑制在这些位点发生切割作用，改变核酸内切限制酶识别序列的特异性；通过甲基化作用将内部的限制酶识别位点保护起来。*酶切消化反应的温度大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况，例如SmaⅠ是25℃、MaeⅠ是45℃。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。*DNA的分子结构•DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。——位点偏爱（Sitepreference）位点偏爱（Sitepreference）EcoRⅠ酶切割噬菌体中的5个位点时不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；EcoRⅠ和HindⅢ在噬菌体DNA中的切割速率分别有10倍和14倍的差异。噬菌体DNA有4个SacⅡ位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快50倍。EcoRⅠ对腺病毒2DNA不同位置切点的切割速率也不同。*核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的标准缓冲液的组份包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCl、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。Mg2+的作用是提供二价的阳离子。缓冲液Tris-HCl使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以NaCl来满足，浓度分别为100mM、50mM和0mM。NEBuffer1（黄色）：10mMBisTris丙烷-HCl,10mMMgCl2,1mMDTT（pH7.0@25℃）。NEBuffer2（蓝色）：10mMTris-HCl,10mMMgCl2,50mMNaCl,1mMDTT（pH7.9@25℃）。NEBuffer3（红色）：50mMTris-HCl,10mMMgCl2,100mMNaCl,1mMDTT（pH7.9@25