SOD、POD、CAT、MDA的测定

-1-植物组织中SOD、POD、CAT、MDA的测定一、磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O31.21g，用蒸馏水定容至1000ml。B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O71.64g，用蒸馏水定容至1000ml。）二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5mlPH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。三、SOD的测定（NBT法)：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M磷酸缓冲液（pH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2)130mMMet(甲硫氨酸)：取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4)100μMEDTA-Na2:取0.0372gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；(5)20μMFD(核黄素):0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。用前配，避光！！！SOD反应液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：核黄素（FD）：H2O的比例为15：3：3：3：3：2.5，按母液顺序配制。2.SOD的测定：取5ml离心管，吸取20μl的酶液，加入3ml反应液，4000Lux照光30分钟，同时取四支试管，三支做对照，一支做空白（不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm比色。3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（ACK—AE）×V／（W×0.5×ACK）单位：NBT光还原50%为单位SOD比活性（酶单位/mg蛋白）=SOD总活性/蛋白质浓度四、POD的测定：1.0.1MpH6.0磷酸缓冲液的配制：0.2MNa2HPO4(B液)6.15mL与0.2MNaH2PO4(A液)43.85mL充分混匀定容至100ml2.POD反应液的配制：0.1MpH6.0的磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219μl混合，保存于冰箱中。3.POD的测定：20μl酶液+3ml反应液于比色皿中，在470nm下每隔1分钟读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变化值（ΔA470/min·mgpr或ΔA470/mgFW）表示酶活力的大小。4.结果计算：POD活性（ΔA470/min·gFW）=ΔA470×V/Va/W=ΔA470×5/0.02/0.5=ΔA470×500五、CAT的测定：1.CAT反应液的配制：0.1MH2O2溶液：0.568ml30%H2O2定容至100ml。0.1MpH7.0磷酸缓冲液：97.5mlA液+152.5mlB液，定容至500ml。0.1M的H2O25ml+0.1M的PH7.0的磷酸缓冲液20ml（即按1：4的比例）混匀，即为CAT反应液。-2-2.CAT的测定：0.1ml（或50μl）酶液+2.5ml反应液，240纳米下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。3.结果计算：CAT活性（Δ240/min·gFW）=Δ240×/0.05/0.5=Δ240×200=Δ240×V/Va/W六、MDA的测定：1.MDA反应液的配置：0.6gTBA（硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA（三氯乙酸）定容至100ml。2.MDA的测定：1ml酶液+2ml0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后再离心，取上清液，在600、532、450nm三个波长下比色。3.结果计算：MDA（μmol/gfw）=(6.45×(D532-D600)-0.56D450)×0.015/W或(6.45×(D532-D600)-0.56D450)×0.03/W