搜索
（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；4、GC含量介于40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10XMbuffer5ulH2O35ul水浴锅100℃2min，锅里隔夜（三）、酶切plko.1载体1、AgeI酶切，反应体系：plko.1载体4ugAgeI2ul10XAgeIbuffer5ulH2O39ul37℃水浴2~3h2、切胶回收AgeI酶切产物，30ul水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI酶切产物30ulEcoRI2ul10XHbuffer5ulH2O13ul37℃水浴2~3h切胶回收，30ul水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4连接：退火引物2ul退火引物5ul酶切载体1ul酶切载体1ulSolutionI5ulT4连接酶1ulH2O2ulT4连接酶Buffer1ulH2O2ul室温下连接4h。（五）、转化-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。（六）、挑菌用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。（七）、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。1、取5ml菌液于离心管，12000rpm1min，弃上清2、向沉淀加500ulP1，震荡重悬3、加入500ulP2，温和翻转6~8次，充分裂解（不超过5min，一般3min）4、加入700ulP3，温和翻转6~8次，出现白色絮状沉淀，12000rpm10min5、将上清加入CS柱（已放入收集管），12000rpm2min，将收集管中液体加入吸附柱CP4中，12000rpm，1min，弃废液6、CP4柱中加入500ulPD,12000rpm，1min，弃液7、CP4柱中加入600ulPw,室温放置3min,12000rpm，1min，弃液8、空离12000rpm，2min，室温放置几分钟（把乙醇蒸发）9、CP4柱置于1.5ml离心管，向柱中心加35ulddH2O，室温放置2min，12000rpm，1min。（八）、测质粒浓度打开软件，ddH2O清洗仪器3~5次，点击black，F1，结果不大于0.2每个样品吸取1ul，于仪器上，F1，结果浓度大于500，OD值1.88~1.90质粒置于-20℃，保存（九）、细胞复苏1、37℃预热PBS，取8mlPBS于10ml离心管中2、液氮中取出冻存的细胞，37℃水浴融化3、吸取冻存细胞于PBS中，轻混匀，室温800rpm3min，去上清，加入1ml培养基重悬，4、细胞重悬液加到含8ml培养基的培养皿中，37℃，5%CO2,培养（十）、细胞分盘1、吸去培养液，加入PBS清洗2、吸去PBS，加入1ml胰酶，37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5ml离心管中，750rpm，室温，5min4、加入1ml培养液重悬，按1；3分盘（十一）、转染1、PLP1625ng/孔PLP2625ng/孔2ml离心管PLP/VSVG625ng/孔混匀目的质粒625ng/孔Opti培养基500ul/孔2、脂质体6ul/孔2ml离心管请轻混匀，室温下孵育，5minOpti培养基500ul/孔将质粒和脂质体混合，轻轻混匀，室温孵育20min3、吸去细胞培养皿中的培养液，加入3mlPBS清洗，加1ml胰酶，37℃消化，加培养液终止消化；收集于5ml离心管，750rpm，室温，5min；弃上清，加入Opti培养液重悬4、在六孔板中加入850ulOpti培养液，加入包装的脂质体，混匀后加入细胞重悬液，十字摇匀，37℃，5%CO2,培养，6~8h后去除培养基，加入3ml新转染培养基，继续培养两天（十二）、收病毒培养第四天的转染细胞，用注射器吸取培养基，用0,45um滤膜过滤到1.5ml离心管，每管1ml。最后向培养皿中再加3ml转染培养基，，继需培养，第二次收病毒。（十三）、病毒转染细胞1、取培养的目的细胞，吸去培养液，加入1ml含4ug/mlpolybrene的慢病毒培养基，再加入1ml病毒液，混匀，37℃，5%CO2，培养48h2、将感染的目的细胞加到生长培养基培养，3、用适当浓度的抗生素筛选靶细胞4、收细胞（十四）、收细胞（用于提蛋白，提RNA）1、吸去培养液，加入PBS清洗2、吸去PBS，加入1ml胰酶，37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5ml离心管中，1000rpm，4℃，5min4、弃上清，加1mlPBS，重悬，转移到1.5ml离心管1000rpm，4℃，5min5、弃上清，立刻放入液氮中保存。（十五）、冻存细胞1、准备冻存液2、吸去培养液，加入PBS清洗3、吸去PBS，加入1ml胰酶，37℃培养箱消化1min4、用巴氏吸管加入2ml培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5ml离心管中，1000rpm，4℃，5min5、弃上清，加入1ml冻存液重悬，转移到冻存管。（十六）、提蛋白1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入细胞裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解30min2、13000rpm，4℃，10min，弃沉淀3、配制蛋白标准液，稀释至0.5mg/ml，配制BCA试剂（A液：B液=50:1）4、标准液体积按0；1；2；4；8；12；16；20加入96孔板，补PBS至20ul5、96孔板加1ul蛋白样品，PBS补足20ul，每个重复3次6、每孔加入200ulBCA，37℃，30min7、酶标仪560nm测吸光值8、将蛋白样品稀释，加入lodingbuffer，4℃，瞬时离心，100℃煮10min，13000rpm，30s（十七）、WB1.清洗玻璃板2.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时待胶面升到绿带下线高度时即可。然后胶上加异丙醇，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）（3）待胶凝后，倒去胶上层异丙醇并用吸水纸吸干。（4）配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。（5）将胶板安装到电泳架上（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。），倒入电泳buffer，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。点样，marker，10ul（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品。）（5）将其放入电泳槽中。3.电泳电泳时间一般100V，90min。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。4、转膜1.剪取一张5.5X8.5的PVDF膜。将切好膜置于甲醇中浸泡，激活，转移到去离子水中清洗。最后在转膜buffer中清洗。2.在加有转膜buffer的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块滤纸垫、一支滚棒、带胶的玻璃板。3.在转膜盒上面铺一张滤纸垫，加入转膜buffer，用滚棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。4.将膜铺于滤纸上；5、将玻璃板撬开，除去大玻璃板后，将浓缩胶切去，取下分离胶盖于膜上上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。最后盖上另一个滤纸垫，擀几下盖上盖子。6.将转膜槽放入转膜仪。25V，30min。5、封闭1、转膜后，移至含有封闭液的平皿中，室温下，摇床上，封闭2h。2、封闭后，1xTBST清洗3次，加入一抗，4℃，过夜；3、回收一抗，1xTBST清洗3次，每次10min；4、加入二抗，室温1h5、弃二抗，1xTBST清洗3次，每次10min。6、显色曝光将膜放到曝光仪上，加入显色液，曝光（十八）、提RNA1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入500裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解30min2、13000rpm，4℃，5min，弃沉淀3、加入适量（350ul~450ul）的RTLlysisBuffer至离心管，重悬4、加入等体积RNABindingBuffer至离心管，混匀5、把HiPureRNAMiniColumn装在2ml收集管，转移小于700ul混合液，12000rpm，30s6、弃滤液，继续转移7、加500ulBufferRW1,12000rpm，30s8、弃滤液，加入650ulBufferRW2，12000rpm，30s9、弃滤液，空离10、柱子转移至1.5ml离心管，加入30~100ulRNaseFreeWater至膜中央，静止1min，12000rpm，1min（十九）、PCR合成cDNA解链反应体系：总RNA1~2ul引物1ulOligo（dT）1ul无RNA酶水补足8ul70℃水浴5min；冰上5min逆转录体系：5XM-MLVbuffer5uldNTP2ulRNase抑制剂1ulM-MLV1ul无RNA酶水8ul总体积25ul42℃，90min；70℃，10minPCR，-20℃保存（二十）、RT-PCR利用持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH作为内参基因，采用荧光定量PCR的方法检查基因的表达水品。1、根据基因和GAPDH的基因序列设计引物，2、反应体系：Mix10ul上游引物0.5ul下游引物0.5ul水7ul模板2ul每个样品设计3个重复，反应条件：95℃变性；60℃退火，设置45个循环。Tm设为95℃（二十一）、softagar底层胶制备：1、2XDMEM培养基预热；1.2%的Agar溶液预热；两者混合2、加到6孔板中。每孔1ml，2个重复，3个对照；加入时避免产生气泡，静置20min，凝固上层胶的制备1、吸去培养液，加入PBS清洗2、吸去PBS，加入1ml胰酶，37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5ml离心管中，750rpm，室温，5min4、加入1ml培养液重悬5、细胞计数，并稀释至适当浓度6、取1.5ml2XDMEM与1.5ml的0.6%Agar溶液混合，再与合适量的的细胞悬液混合（每孔加入2000个细胞），每孔加入1.5ml底层胶。避免产生气泡，静置，凝固7、置于37℃，5%CO2，培养15~20天。（二十二）、BrdU1、取对数生长期细胞，在24孔板上进行细胞爬片（每孔2万细胞），置于37℃，5%CO2培养过夜2、每孔添加500ulBrdU溶液（每毫