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层析技术第一节层析概述层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。一、概况1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。层析技术是一种分离技术，是混合物最有效的分离、分析方法。经典色谱（offline)Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上端;洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过；在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同颜色的清晰色带；将潮湿的碳酸钙挤出玻璃管，用刀将各色带切下，对其中的组分用合适的分析方法分别进行测定。现代色谱（online)当一个二组分（A和B）的混合样品在t1时间从柱头加入;随着流动相不断加入，洗脱作用连续进行，直至A和B组分先后流出柱子而进入检测器;从而使各组分浓度转变成电信号后记录在记录纸上，或显示在荧光屏上，或由电脑贮存后打印出来。层析技术的原理层析系统都由两个相组成：一是固定相(不动的一相)，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相(携带样品流过固定相的流动体)，即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。二、层析法的特点分离效率高：复杂混合物、有机同系物、异构体、手性异构体。灵敏度高：可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。应用范围广不足之处：被分离组分的定性较为困难。层析应用范围凡是溶于水和有机溶剂的分子和离子，在性质上有一定差异均可通过层析方法进行分离。分离的范围包括：无机化合物：无机盐类、无机酸类、络合物类等有机化合物：烷烃类、有机酸和有机胺类、杂环类生物大分子：核酸和核苷酸类、蛋白质、酶及肽类、多糖及寡糖类、激素类活体生物：病毒、细菌、细胞器等分析的参数常见的层析分离法分析技术，是以混合物中分离单一成分，制备一定量的产品为主，以分析鉴定化合物的性质，获得分析参数为辅。HPLC以分析为主。通过层析方法可以对物质进行一定程度的定量、定性和纯度鉴定。按层析原理分类（一）名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相的能力不同金属螯和层析法利用二价金属离子与流动相中的含有半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯和作用而进行分离的方法离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法/排阻层析固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离名称分离原因分配层析被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的作用，在移动的过程汇总物质在两相之间进行分配。疏水层析利用固定相载体表面偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法。反向层析利用固定相载体表面偶联的疏水性较强的配基，在一定非极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质。聚焦层析利用固定相载体表面偶联的载体两性电解质分子，在层析过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分子发生等点聚焦反应进行分离的方法。灌注层析利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流动相中溶质分子相对分子量的差异进行分离的方法。按层析原理分类（二）离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。按层析过程的机理分类按两相所处状态分类流动相液体气体液体液-液层析法气-液层析法固定相固体液-固层析法气-固层析法超临界分析：利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离，更具专一性。按操作形式不同分类名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离层析分类法纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之分离。纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单，操作比较容易，重现性好。三、层析前蛋白质处理主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。1、盐析法盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。2、等电点沉淀在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。3、有机溶剂沉淀降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀；有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。四、层析基本操作过程装置选择上样和洗脱结果检测上样均一性洗脱装置目的不同检测方法不同活性检测基质均匀性柱层析的L/d比值1、柱层析的L/d比值2、洗脱装置不改变溶剂体系依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵维持流速恒定的简易装置改变溶剂系统♦分级洗脱在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密，同一个洗脱级组分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析改变溶剂系统♦梯度洗脱一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。线性梯度洗脱装置♦性能未知样品的蛋白质分离：改变缓慢的梯度洗脱→若为单峰：分级洗脱3、结果检测活性检测比活没有提高目的蛋白与杂蛋白并没有分开比活有所提高，但总活性回收很低目的蛋白有损失或有失活现象测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性结果保存薄层层析&纸层析照相保存or扫描仪转为图形or积分仪变成数据柱层析检测器、记录仪和积分仪处理4、层析装置的仪器化HPLC与电脑、质谱等连用伯乐公司duoflow中高压层析仪安马西亚公司akta高效快速层析仪液相层析技术概况分离范围：无机化合物有机化合物生物大分子活体生物应用范围：大规模生产小型制备、微量分离定性定量分析液相层析仪伯乐公司duoflow中高压层析仪安马西亚公司AKTA高效快速层析仪组份收集器操作控制动力系统工作台层析柱管填充技术介质的预处理：溶胀、漂洗、再生、转型、脱气等湿法填充：搅拌悬浮，自然沉降。填充质量检测器紫外检测器荧光检测器折光检测器电导检测器固定相固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又称为层析介质、层析填料、填充剂等。包括：无机材料：硅胶，氧化铝有机材料：聚苯乙烯等多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺层析介质与生物大分子的关系大孔径的，亲水性好的球形材料。多糖类凝胶层析介质最常用SephadexSepharoseBio-Gel缺点：刚性差，不耐压，分离时间长层析介质的性能层析介质的形状：球形，不定形技术指标粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢均匀度：均匀，流速快，峰值集中机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。流动相流动相缓冲溶液：根据待分离物质的性质（等电点、极性、溶解度、稳定性等）选择缓冲溶液及其浓度、pH值、离子强度、缓冲容量等。保护剂：抗氧化剂、稳定剂、蛋白酶抑制剂等有机溶剂：根据待检测物质的极性及溶解度来选择不同极性的溶剂。第一节吸附层析吸附层析定义：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法。原理：层析介质表面的吸附基团对溶质发生吸附作用，该基团对不同溶质的吸附能力的强弱有较大的差异，可根据这种差异性，将不同溶质进行分离。原理根据物料中各组分对固定相(吸附剂)的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。经反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的过程，达到分离目的。无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用。吸附力的产生吸附吸附：任何两相都可以形成界面，其中一相的物质或溶解在其中的溶质在另一相表面上发生密集行为。吸附现象：溶质从溶液中到停留在固体表面上的现象，固-气、固-液、气-液。吸附介质：凡是能够将周围其他分子聚集到某一物质表面上的材料。被吸附物质：能够聚集在吸附介质表面的分子。吸附种类物理吸附：是依靠分子间相互作用的范德华力引起的吸附，非特异性吸附，吸附速度快，吸附力较强。化学吸附：是依靠物质中的化学键的作用引起吸附，是选择性吸附，吸附速度慢，吸附力强，不易解吸。复合吸附：是指物理和化学吸附同时发生。饱和吸附：在单位时间内被吸附物在吸附介质某一表面积上的分子与同一单位时间内的该介质的同一表面上解吸附的分子达到了动态平衡，处于该环境中吸附介质的吸附作用达到饱和。吸附剂的选择性能：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉极性：羟基磷灰石，硅胶，氧化铝，人造沸石非极性：活性炭吸附剂活性炭硅胶氧化铝聚酰胺羟基磷灰石吸附介质的分类及其性质（一）羟基磷灰石特点：抗机械强度弱。原理：溶质分子中的酸性基团与洗脱液中的磷酸根离子对羟基磷灰石中的钙离子有竞争作用。应用：分离有序和无序的生物大分子，如分离RNA和DNA等。吸附介质的分类及其性质（二）硅胶：化学性质稳定、吸附量大。原理：颗粒表面存在的很多硅酰基作为活性中心与所进行层析的化合物形成强的氢键作用。硅酰基能够通过氢键的形成而吸附水分，并随着吸着的水分增加而降低吸附力。制备：一种多孔性物质,因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-结合而具有三维结构,表面具有硅羟基,作吸附剂的硅胶需经加热处理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔径分布