常规组织病理技术

1徐州医学院病理学教研室常规组织病理技术2病理学是研究疾病发生发展规律的学科，主要的研究范围是疾病发生发展过程中组织、细胞代谢、功能及结构的变化。病理学的发展与科学技术发展息息相关，因为病理学的发展与使用的工具和方法（即技术）的更新密切相关。3解剖剪刀尸体解剖器官病理学显微镜细胞细胞病理学电镜超微结构超微病理学免疫学免疫组化免疫病理学分子生物学分子病理学计算机及网络信息病理学工具和方法的更新与病理学的发展4病理学理论病理学技术病理学理论5技术是病理学发展之母！6病理学传统病理学现代病理学↓↓形态学以形态学为基础器官病理学与其他技术相结合细胞病理学免疫病理学超微病理学分子病理学……7病理学技术传统病理学技术常规组织病理技术（formalin固定石蜡切片HE）现代新技术8免疫组化HE乳腺导管9免疫荧光HE10结肠癌EB病毒原位分子杂交11Fish检测人类表皮生长因子受体2基因（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2）12常规组织病理技术内容——formalin固定石蜡切片制作HE染色等基本——研究形态学必不可少的重要方法基础——常规组织病理技术是现代新技术基础优点——简单易操作，基本满足日常工作需要（常规技术、常规染色）13取材HE染色封固常规技术基本流程固定切片常规技术的完成是制作出染色良好的HE切片脱水、透明、浸蜡、包埋14HE15第一节组织与细胞标本的选择组织标本的选择即取材，取材的目的是正确的获取所需要的标本或标本的某一部位。16一、组织标本的选择（取材）从大体标本上按病理检查或研究的目的、要求切取适当大小的组织块，供制片进行显微镜检查。17材料要求：新鲜、数量、质量取材包括两个步骤：从人体（活检、手术、尸检）或动物体上获取器官、组织↓进一步将其切取为制片所需组织块18切取组织块必须注意下列几点：1.避免人为损伤组织：2.取材部位总的要求——能够反应组织结构特点及病变特点且能够表明病变部位与周围组织的关系。（1）组织块应包括各脏器的重要结构19肾脏取材20取材21（2）组织块的采取应在主要病变部位及正常与病变交界处2223（3）肿瘤标本的选择肿瘤本身、边缘、肿瘤连同脏器表面和底、切端，转移灶，尽量避开继发病变24乳腺癌25胃26注意包埋面273.组织块大小一般不超过2×1.5×0.3cm为宜284.取材数量原则:凡可疑处均要取材295.编号、标记306.取材剩余组织块可放于70%酒精中保存有利于日后再取材时细胞染色，瓶子内外亦需以标签注明号码。注意：⑴尽量保留一定量的组织⑵不要随意丢弃标本317.脱钙骨组织需先脱钙再取材32二、细胞取材及制片收集和制片方法1.印片法2.穿刺法3.沉淀法4.活细胞标本的制备33第二节组织的固定凡是需要制作病理检查标本的各种组织，无论是制作切片标本还是大体标本，首先必须固定。固定的目的是使离体的组织、细胞尽量保持生活状态以利观察、研究。34一、概念将各种组织浸入某些化学试剂内，使细胞内的物质能尽量保持其生活状态的形态结构和位置，叫做固定。35二.固定组织的目的（1）保持细胞与生活时的形态相似（自溶、腐败）；（2）固定可使组织内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分凝固成不溶性物质，保持其原来结构；（3）增加组织对染料的亲和力，易着色；（4）组织硬化，便于取材、切片。36由组织固定不当或不良对标本造成的影响是无法纠正和弥补的!37383940三.固定注意事项（1）固定的组织越新鲜越好（2）固定液的量：约1：10固定容器：足够大,开口不宜太小（3）固定的温度：室温(25℃)（4）特殊类型染色对固定要求严格，组织的大小、固定的时间、温度的适当都应注意。41有专家说：若你能取到新鲜的组织，能切到厚2~4mm的切块和记得固定液是十倍于组织块的总体积，你的诊断的正确性已得到了80﹪的保证。42四.固定剂和固定液用于固定组织的化学物质称为固定剂或固定液。固定剂/单纯固定液—由单一化学物质组成混合固定液/复合固定液—由多种化学物质混合组成43(一)单纯固定液1.甲醛：优点●固定后的组织很少收缩。●能保存脂肪和类脂质（用冰冻切片法），也可固定高尔基体、线粒体，又是糖的保存剂，使肝糖变成微细的颗粒团。●穿透力强（4小时穿透深度2.7mm，8小时为4.7mm，12小时为5mm），固定均匀，能增加组织的韧性，便于取材。●甲醛固定的标本核染色甚佳。●价格低廉。44缺点：●经甲醛固定的陈旧组织，尤以多血的肝脾组织易发生黑色或棕黑色的沉积（粒状结晶），称甲醛色素。甲醛氧化---蚁酸与血红蛋白结合—福尔马林色素避免长时间固定，固定后流水冲洗●尿酸结晶可被溶解。45甲醛固定液的配制:（1）10%formalin市售甲醛（浓度为37~40%）1份水9份(2)中性甲醛以PH7.2-7.4PBS为溶液配制的甲醛固定液46优点：●如要证明尿酸结晶和保存糖类，则须用100%酒精固定。●在已用别种固定液后，可用70%酒精较久的保存组织。●酒精既有固定作用，又有脱水作用。47缺点：●经酒精固定的标本对核的染色不良，也不利于染色体的固定。●要证明细胞含的脂肪和类脂质时，不能用酒精固定。●如要证明组织内的色素时，不宜以酒精作为固定剂。●不适用于固定大块组织。●酒精价格较贵。4880%-95%的酒精作为固定剂为好高浓度酒精组织硬化显著,放置过久组织收缩明显且质脆,不但影响制片,组织形态也不好。很少单独使用49（二）复合固定液1.A-F液（酒精-甲醛固定液）有固定兼脱水作用配制方法:95%酒精（A）90ml40%甲醛（F）10ml502.Carnoy液固定胞浆和胞核,对染色体固定佳,显示DNA和RNA效果好.也常用于糖原和尼氏体的固定.不能保存脂质有防止酒精的硬化收缩作用,穿透力强,适用于外膜致密的组织配置方法：无水酒精60ml，冰醋酸10ml，氯仿30ml51五.常用的固定方法——浸泡法其他方法：蒸汽固定法：甲醛蒸汽小而薄的组织、细胞细胞涂片的固定方法可采用浸入法和滴加法防摩擦脱落防交叉污染防混淆微波固定法：优点是核膜清晰，染色质均匀，组织收缩小；缺点是时间及温度(63-65℃)不易控制灌注固定法加热蒸汽52组织固定后的冲洗流水冲洗冲洗的时间与组织块的大小、固定时间的长短有关大标本——24小时小标本——2~10小时53第三节组织切片技术54脱水透明浸蜡封固制作切片的方法和程序制作切片的主要过程包埋染色切片55一、脱水某些溶剂置换组织内水分的过程（一）目的石蜡切片组织中含大量水分水与石蜡不能混合必须脱去组织中的水分56（二）脱水剂能够使组织脱水的化学物质称为脱水剂。常用脱水剂；与水任意比例混合酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、环己酮57（三）脱水步骤和时间脱水时间和组织块大小有关，一般大小为1.8㎝×1.8㎝，厚约0.2~0.3㎝的组织，其脱水步骤和时间如下：●70%酒精1~2h●80%酒精2~4h●90%酒精2~4h●95%酒精Ⅰ2~4h●95%酒精Ⅱ2~4h●无水酒精Ⅰ2~4h●无水酒精Ⅱ2~4h递增酒精浓度可避免组织过度收缩58自动脱水机59(四)脱水的注意事项组织脱水必须掌握由低浓度向高浓度逐步过渡的原则脱水时间要适度组织脱水要彻底干净酒精的浓度适时更换降级使用60二、透明组织经酒精脱水后，还必须经过一个媒剂透明过程既与酒精混合又溶解于石蜡酒精石蜡媒剂使组织透明61常用透明剂二甲苯、甲苯、氯仿、香柏油等最常用二甲苯（折光率1.497）约30min62三、浸蜡经过透明的组织块，进一步移入熔化的石蜡内浸渍，称为浸蜡。用其他浸透剂（火棉胶，碳蜡，明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入目的：使石蜡充分进入组织中，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块而便于切片63注意:●在浸蜡过程中，一般要2次或3次更换蜡缸●浸蜡时间，一般更换3次石蜡总共在3h左右●浸蜡在温箱中进行温度！●浸蜡用的石蜡要定期更新（降级使用）浸蜡用石蜡熔点较低,52-56℃64四、包埋使用包埋剂将处理过的组织包于其中，使组织达到一定韧度和硬度，有利于切片。石蜡包埋法；快速石蜡包埋法等6566包埋676869蜡块7071组织芯片制作方法：组织芯片又称组织微列阵，是将数十个、数百个、乃至上千个小的组织片整齐的排列在某一载体上（通常是载波片）而成的微缩组织切片。制作：采用石蜡包埋法优点：方法简单易操作各组织基本在同一平面蜡与组织融合较好，不会出现崩块现象较小的蜡块可以包埋较多的组织附72五石蜡切片组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。一般切成4~6μm，特殊情况可切1~2μm优点：操作简便、便于大批制作、便于長期保存73切片前的准备：高质量的蜡块和锋利的切片刀是保证切片质量的关键清洁的载玻片、恒温烤片装置、优质狼豪毛笔、弯嘴镊过程：切片、贴附、烤片74轮转式切片机切片7576组织漂烘仪＞40℃,＜蜡的熔点60~70℃贴片77切片的注意事项●首先要求切片刀锋利，刀口无缺损，才能切出完整薄片●蜡块四周在切片时应修切整齐，尤其是上、下缘，要求平行●切片刀及蜡块都要固定牢靠，机身的各个部分及螺丝应予旋紧，不可产生震动，摇动切片机时，用力不能过猛，以保持机身平稳，防止震动●切片刀倾角不宜过大或过小，以20～30℃为佳●石蜡过软或室温过高，切片易粘于切片刀上，或发生皱缩，此时可将蜡块置于水槽内冷冻后再切。反之，如室温过低或石蜡过硬，切不成片时，可在蜡块切面上哈气加温78附：冰冻切片保存酶类和抗原活性，尤其是对热或有机溶剂耐受能力弱的酶及细胞表面抗原术中快速病理诊断、某些特殊染色、某些免疫组织化学染色,原位分子杂交注意：用于切片形态学观察要注意防止冰晶形成--速冻科学研究：RNA，DNA提取79六普通染色HE苏木精hematoxlin和伊红eosin染色常规染色染色的目的：增加组织在显微镜下的分辨率HE染色主要用以显示各种组织、细胞的一般形态结构以及疾病过程中病变的发生、发展及修复的过程。常规染色特殊染色80（一）染色原理1、细胞核染色原理：核酸阴离子+苏木素阳离子→蓝色2、细胞浆染色原理：蛋白质阳离子+伊红阴离子→伊红色PH值低于蛋白质等电点3、分化和蓝化作用：分化：1%盐酸脱去多余染液蓝化：弱碱性液体使苏木素处于蓝色离子状态而使细胞核染上蓝色81染色缸染色架82全自动染色机83（二）染液及溶液的配制1、苏木精染液染核苏木精染液的配制方法很多，如哈瑞（Harris）苏木精染液，埃利希（Ehrlich）苏木精染液，德拉菲尔德（Delafield）苏木精染液，迈耶（Mayer）苏木精染液，克拉兹（Carazzi）苏木精染液等。842、伊红染液染胞浆伊红染液的浓度为０.２５％～１％。一般而言，其浓度低时，染色时间延长。可以是水溶液，也可以是醇溶液。853、分化液a)1%盐酸酒精溶液：盐酸1ml，70%酒精99mlb)0.5%～1%盐酸水溶液：盐酸0.5～1ml，加蒸馏水99ml以上两种溶液以1%盐酸酒精溶液最常用。864、弱碱性水溶液(1)碳酸锂水溶液：碳酸锂1.25g溶于蒸馏水100ml。PH值为8.0左右。(2)氢氧化铵水溶液：将氢氧化铵（氨水）逐滴加入蒸馏水中，经搅拌后，用pH试纸检验溶液，pH值调至7.5～8.0之间即可。【注意】以上两种“弱碱性水溶液：为返蓝剂，使苏木精染色返为蓝色。使用流水冲洗1～2h也可起到返蓝作用，因为自来水亦呈弱碱性。87（三）染色程序与方法常规石蜡切片HE染色大体分三个步骤：1、染色前切片脱蜡水洗染色剂为水溶性，水与石蜡不溶，在染色前必须将石蜡脱尽，否则不能染色。脱蜡时间宁长勿短。二甲苯脱蜡酒精洗去二甲苯水88步骤：（1）二甲苯Ⅰ5min（烘干切片浸入，脱蜡）（2）二甲苯Ⅱ1～5min（充分溶解残存切片上石蜡）（3）无水酒精Ⅰ1～2min（洗去二甲苯）（4）无水酒精Ⅱ1～2min（彻底洗出二甲苯）（5）95%酒精1～2min（6）85%酒精1～2min（7）70%酒精1～2min（用各级酒精清洗切片中的二甲苯，同时切片逐步加水，不可直接由无水酒精入水，可致切片漂浮脱落）。（8）自来水洗1