PKM2翻译后修饰的鉴定

PKM2翻译后修饰的鉴定摘要：丙酮酸激酶（PyruvateKinase，PK）是催化糖酵解最后一步反应的关键酶，在肿瘤细胞代谢及生长中起着至关重要的作用。它在人体内存在四种同工酶：L、R、M1和M2型，M2型（即PKM2）特异高表达于胚胎及成体干细胞。蛋白质翻译后修饰在维持蛋白质功能，调节信号传导以及大量其他重要的细胞生命过程中发挥着关键性的作用。PKM2的丙酮酸激酶活性受外界环境和蛋白质翻译后修饰调控。本研究利用免疫沉淀，胶内酶解和质谱等技术鉴定出PKM2上存在17个磷酸化修饰位点，10个乙酰化修饰位点，1个甲基化修饰位点，这为进一步研究各种修饰的生物学效应及其交互应答奠定了良好的基础。关键词：PKM2；蛋白质翻译后修饰；交互应答Theidentificationofproteinpost-translationalmodificationsofPKM2StudentmajoringinNationalLifeScienceandTechniqueTalentTrainingBaseAbstract：Pyruvatekinase(PyruvateKinase,PK)isthekeyenzymewhichcatalyzesthelaststepofglycolysisandplaysavitalroleinthemetabolismandgrowthoftumorcells.Itincludesfourisoenzymesinthehumanbody:typeL,typeR,typeM1andtypeM2.TypeM2(PKM2)specificallyandhighlyexpressinembryoniccellsandadultstemcells.Proteinpost-translationalmodificationplaysakeyroleinthemaintenanceofproteinfunction,regulatingsignalpathway,aswellasinanumberofimportantprocessesofcells.PyruvatekinaseactivityofPKM2isregulatedbytheexternalenvironmentandtheregulationofproteinpost-translationalmodifications.Totally,17phosphorylatedsites,10acetylatedsites,and1methylatedsitesonPKM2havebeenidentifiedbyimmunoprecipitation,geldigestionandLC-MS.Itlaysagoodfoundationforthefurtherstudyofcross-talkofthesemodifications.Keywords:PKM2;Post-translationalmodification;Cross-talk1引言1.1PKM2丙酮酸激酶（PK）调节糖酵解的最终限速步骤并催化磷酸基团从磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转移到二磷酸腺苷，该转移产生一个丙酮酸和一个三磷酸腺苷[8,9]PKM1、PKM2、PKL和PKR是不同类型的PK异构体，在哺乳动物细胞和组织中表达。PKM2是由核蛋白A1/2和多嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidinetractbindingprotein，PTB)调控PKM前mRNA可变剪接形成的。PKM2在胚胎中表达，随着胚胎发育，PKM2逐渐被其他同工酶代替，但在肿瘤发生过程中PKM2表达上升并取代其他同工酶，如肝癌中PKL消失，而PKM2大量表达[1]PKM2是肿瘤代谢领域的热点之一。结合最近三年的文献，发现PKM2被多种复杂的机制调控，通过改变表达量或酶活在多个层面调节肿瘤细胞代谢和生长。PKM2有四聚体和二聚体两种构象，分别具有不同的酶活性，在细胞质中主要以四聚体存在，具有高丙酮酸激酶活性；二聚体可入核，具有高蛋白激酶活性。中间代谢产物和蛋白质翻译后修饰等细胞内外因素调控PKM2构象转换，使肿瘤细胞根据不同需要在产生能量和合成生物大分子之间快速转换，有效维持肿瘤能量和合成原料供应的平衡，这极大地增强了肿瘤细胞对环境的适应力。FBP是PKM2构象转换的重要调节因子[3-5]PKM2促进癌细胞生长是通过减慢糖酵解使碳水化合物代谢产物进入其他次要途径，包括己糖胺途径，二磷酸尿苷（UDP）葡萄糖合成，甘油合成和PPP，PPP产生的大分子前体，有助于细胞增殖和还原物如NADPH的减少。随后的研究证实，表达PKM2的肺癌细胞比表达PKM1的细胞致癌性更大。通过调节外显子剪接可以使PKM2相对于PKM1优先表达。PK的mRNA剪接后包含外显子9翻译所得PKM1亚型，而包含外显子10的mRNA则会翻译得PKM2。MYC基因会上调核不均一核糖核蛋白(heterogeneousnuclearribonucleoprotein,hnRNPs)它与PKmRNA的外显子9相结合导致mRNA中包含外显子10，从而主要表达PKM2。通过促进PKM2表达，MYC产生更多的NADPH，与ATP的增加相同步，并满足不断增殖的辅助需求。在临床上，PKM2高表达于各种癌症类型患者的样品中，从而发现PKM2可能对于早期检测癌症的是个有用的生物标志物。由此可见，进一步研究PKM2在癌症中的普遍性以及PKM2在肿瘤发生中的作用意义重大。1.2PKM2蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰(Proteinpost-translationalmodificationPTM)是指通过共价键连接官能团或蛋白质，调节蛋白亚基的水解，或降解整个蛋白来提高蛋白质的功能多样性。超过200种不同的翻译后修饰已被报道，包括磷酸化，糖基化，泛素化，亚硝基化，甲基化及乙酰化等[43]众所周知，蛋白质翻译后修饰在维持蛋白质功能，如活性，稳定性和交互作用以及信号调节和大量其他重要的细胞生命活动中发挥着关键性的作用。磷酸化是研究最普遍和最深入的后修饰，是调节细胞生命活动的最常见的调控方式之一。从古至今，几乎存在于每个哺乳动物体内。通常蛋白激酶上数个氨基酸（羟基，酸性基或氨基，咪唑氮环）侧链反应性基团会发生磷酸化。磷酸化在细胞信号转导过程中扮演着重要的角色。Soufi等研究显示发生在细菌中的S/T/Y磷酸化在调控细菌的生理过程中起重要作用，如细胞周期[20]细胞分化[21]应激反应[22]胞外多糖生产[23]等等。赵等发现各种不同亚型的组蛋白的磷酸化分别参与了基因转录、DNA修复、细胞凋亡及染色体浓缩等过程,并与其他修饰方式共同调控细胞生长、分裂等生命活动。乙酰化是通过乙酰辅酶A（乙酰-CoA）将乙酰基共价结合到蛋白质上的过程[35]这个过程是由乙酰转移酶完成的，并且也可以由脱乙酰基酶去除（除了N端乙酰化均可逆）这种修饰一般发生在N-末端，赖氨酸残基，以及S/T残基。蛋白质甲基化是指由甲基转移酶催化，甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至相应的蛋白质，可形成任一可逆的甲基化，但O-羧基基团如甲基化则形成不可逆的甲基。蛋白甲基化是可以发生在许多残基包括精氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酰胺和脯氨酸中。在许多细胞过程，如转录活性，DNA修复中甲基化起着至关重要的作用。比如Stallcu等发现组蛋白的赖氨酸甲基化与细胞核的转录活性相关，并调节其他类型的组蛋白修饰，是细胞的正常有丝分裂所必需的。PKM2的丙酮酸激酶活性受外界环境和蛋白质翻译后修饰调控。磷酸化是PKM2的一种重要修饰手段，成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）可促使PKM2第105位酪氨酸磷酸化，消除FBP对PKM2的变构效应[6]吕等人的研究显示：高浓度葡萄糖可促使PKM2第305位赖氨酸乙酰化，抑制PKM2酶活并促使其通过自噬途径被降解；PKM2乙酰化可促使肿瘤细胞内糖酵解中间产物累积，促进肿瘤生长[4]PKM2的第433位赖氨酸位点乙酰化可被有丝分裂和原癌基因调控，乙酰化干扰了PKM2与FBP结合并促使PKM2入核，增强其蛋白激酶活性[5]1.3蛋白质翻译后修饰间交互应答蛋白质翻译后修饰作为高度灵活的开关，调控蛋白质的活性、浓度及定位等多种功能。迄今为止，大部分研究都只关注一种类型的修饰，然而在蛋白质的翻译后修饰之间存在广泛的交互应答（Cross-Talk）即一种修饰的存在会影响其他修饰的出现。如Noort等发现在细菌中乙酰化和磷酸化同时存在于同一个蛋白中[17]Swaney等发现在酵母细胞蛋白质降解过程中蛋白质的磷酸化与泛素化发生了显著的交互应答，在466个蛋白中同时存在磷酸化和泛素化修饰[18]在单个的具有复杂而重要功能的蛋白质上存在不同翻译后修饰之间的交互应答：如p53的磷酸化能增强p300对其乙酰化，影响p53的转录激活[19]组蛋白H3上28位丝氨酸的磷酸化能诱导27位赖氨酸的甲基化和乙酰化之间的转换，从而影响基因的转录[20]相关文献报道，PKM2多个赖氨酸位点存在乙酰化、泛素化和琥珀酰化两种或三种修饰；丝氨酸或苏氨酸位点周围五个氨基酸内存在赖氨酸位点，如S87可被磷酸化，K89可被乙酰化和泛素化，揭示PKM2翻译后修饰之间可能也存在交互应答，调控了PKM2丙酮酸激酶和蛋白激酶活性之间的平衡和转换，从而调控肿瘤细胞生长。目前PKM2复杂的分子调控机制及蛋白质翻译后修饰之间是否存在交互应答等研究尚有很多空白。因此，本课题将主要鉴定PKM2的蛋白质翻译后修饰。构建PKM2的表达质粒，利用免疫沉淀，胶内酶解，质谱等技术鉴定磷酸化、乙酰化和甲基化等修饰的具体位点，为阐明蛋白质翻译后修饰间交互应答的方式，以及为蛋白质翻译后修饰对PKM2丙酮酸激酶活性和蛋白激酶活性的平衡以促进肿瘤生长的机制研究提供依据。2材料与方法2.1材料2.1.1细胞株肝癌细胞株MHCC97-H由中科院细胞库提供,人胚肾细胞株HEK293T由本实验室保存。2.1.2真核表达质粒含Flag标签的pcDNA3.1（+）质粒本实验保存。2.1.3主要试剂DMEM/HIGHGLUCOSE、胎牛血清购自HyClone;0.25％胰酶溶液购自GIBCO；ECLPlus试剂盒购自CTB；一抗稀释液、二抗稀释液、RIPA裂解液购自Beyotime；Tris-base、甘氨酸、丙烯酰胺、过硫酸胺均购自Amrosco公司；琼脂糖，琼脂粉，酵母提取物，蛋白胨，甲醇，乙醇，异丙醇，乙酸，NaCl，KCl，KH2PO4，Na2HPO4•12H2O，EDTA，DMSO，均购自上海生工公司；DTT,IAA均购自北京拜尔迪生物技术有限公司；MassSpectraGradeModifiedTrypsin购自华利世科技；抗体Flag购自SIGMA。2.1.4仪器设备电子精密天平（Mettler）PCRSystem970(AppliedBiosystem)恒流恒压电泳仪（Bio-Rad）LAS-3000（BioTek）生物安全柜（Labconco）CO2培养箱（Thermo）离心机（Eppendorf）80℃冰箱（Thermo）超纯水系统（Millipore）酶标仪（BioTek）流式细胞仪（BeckmanCoulter）紫外分光光度仪（Thermo）旋涡混合器（Thermo）磁力加热搅拌器（江苏省金坛市医疗仪器厂）低温摇床（上海一恒科技）超净工作台（苏州净化设备厂）三孔智能水浴锅（大研仪器公司）高压灭菌锅（上海坤肯灭菌锅）可调温度摇床（上海一恒科技）细胞培养皿（10cm、6cm）移液枪，离心管Tip头和EP管(Axygen公司)LTQ-Orbitrap质谱仪，Imager-master扫描仪等。2.1.5主要溶液配制细胞培养相关溶液：10×磷酸盐缓冲液（10×PBS）80gNaCl、35.8gNa2HPO4•12H2O、2.4gKH2PO4，加入800mLddH2O中，搅拌溶解后，调pH至7.4，定容至1L，高压灭菌后置于4℃，用前稀释成1×使用液。10×TBS缓冲液：80gNaCl、2gK