气相色谱―质谱联用原理及应用

气相色谱—质谱联用原理及应用简介色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。液质联用与气质联用的区别:气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。Neutral101102103104105MolecularWeightIonicAnalytePolarityIonSprayAPCIGC/MS现代有机和生物质谱进展在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量500以下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸离子化技术，能够测定分子量高达1500~2000的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）应运而生。质谱原理简介：质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。常见术语:质荷比:离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.峰:质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.离子丰度:检测器检测到的离子信号强度.基峰:在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子如何看质谱图：(1)确定分子离子,即确定分子量氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在3~8和10~13，21~25之间均不可能，则说明是碎片或杂质。(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:(3)峰强度与结构的关系丰度大反映离子结构稳定在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。质谱解析的一般步骤(适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好)(1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当(2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等.(3)尽可能判断出分子离子。(4)假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H，CH3，H2O，HF，OCH3......(5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对比。有机质谱的特点优点:(1)定分子量准确，其它技术无法比。(2)灵敏度高，常规10-7—10-8g,单离子检测可达10-12g。(3)快速，几分甚至几秒。(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS对于难分离的混合物特别有效,其它技术无法胜任。(5)多功能，广泛适用于各类化合物。局限性:(1)异构体，立体化学方面区分能力差。(2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所以不能象低场NMR，IR等自己动手，须专人操作。(3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题。(4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。质谱计框图加速区真空系统计算机数据处理系统进样系统离子源质量分析器检测器检测记录系统质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器。经接收放大后被记录。M-15(CH3)M-17(OH,NH3)M-19(F)M-27(HCN,C2H3)M-29(CHO,C2H5)M-31(CH2OH,OCH3)M-43(CH3CO,C3H7)M-45(OC2H5,COOH)M-79(Br)M-16(O,NH2)M-18(H2O)M-26(C2H2)M-28(CO,C2H4)M-30(NO)M-32(S,CH3OH)M-42(CH2CO,CH2N2)M-44(CO2,CS2)M-46(NO2,C2H5OH)M-127(I)M-35(Cl)Table.2常见的离子碎片20304050607080901004357m/z100(M)712972H2CCCH2OCH2H3CCH3H2CCOH3C[CH2CH2CH3]-m/z=57(75%)CCH2OCH2CH3H2C][H3C-m/z=71(48%)H2CCCH2OCH2H3CCH3Fig.113-己酮的MS图谱气相色谱-质谱联用技术及其在代谢组学中的应用2020/2/2619代谢组学是以高通量、高灵敏度、高分辨率的现代仪器分析方法为手段，对细胞、体液、组织中所有代谢物进行无偏向的定性与定量分析的一门学科。气相色谱-质谱联用技术具有较高的检测灵敏度和鉴定准确度，通过标准谱图库的比对可对代谢物进行快速的鉴定，因此被广泛应用于生物样品的代谢产物的检测中。2020/2/2620在GC-MS检测中选用衍生化试剂需注意衍生化产物的质谱特性，即质量碎片的特征性强，同时分子量要适中，既适合质量型检测器检测，也有利于与基质干扰物分离。常用的衍生化试剂分为硅烷化、酰化和烷基化三类，其反应原理及优缺点见表1，其中应用最广泛的是硅烷化试剂和酰化试剂2020/2/26212020/2/2622利用GC-MS分析生物体内的代谢物，需要对样品进行预处理及衍生化，预处理过程主要包括代谢淬灭、细胞浓缩、代谢物提取等。为获取微生物具有代表性的样品，分析时样品的代谢组成分必须保证与取样时一致，才能反映样品当时的代谢活动，因此这一反映特定生理状态的代谢状态必须要被“固定”住，直到分析完成，该过程称为淬灭。由于不同微生物细胞壁的结构不同，对渗透压的耐受程度以及膜通透性也存在差异，因此代谢淬灭所选择的方法也无法统一。2020/2/2623GC-MS检测中物质的定性需要利用其质谱进行数据检索，故其分析过程离不开各种代谢途径和生物化学的数据库。基因组学和蛋白质组学已有较完善的书库供搜索、使用，而代谢组学尚未有类似功能完备的数据库，但一些生化数据库可用于已知代谢物的生物功能解释和未知代谢物的结构鉴定，如京都基因与基因组百科在代谢组学研究中，为确保分析数据的有效性与可靠性，需要进行定量分析以减少样品处理及检测中产生的差异。基于气相色谱－质谱联用技术转人血清白蛋白水稻的代谢组学方法研究2020/2/2624随着生物技术的日趋成熟及基因工程的不断发展，转基因作物品种日益增多。转人血清白蛋白水稻是一种可以从稻米中提取人血清白蛋白，用于医疗方面的水稻。对此水稻进行代谢物研究，有利于转基因作物安全性的评估，对研究基因功能，推进代谢组学研究有重要意义。目前，在植物代谢物的研究中，气质联用是比较常用的仪器，其分离效率高，峰容量大、灵敏度高。Fiehn等用GC-MS检测拟南芥叶子提取物中找到了326个化合物，并且半数可以确定其化学结构，对代谢组学研究做出很大的贡献。实验方法2020/2/2625将水稻种子脱壳；用混合球磨仪将水稻种子磨成细粉；将末分装为100mｇ/份，分别加入１ｍＬ提取溶液，漩涡震荡10s；在热混合仪上４℃浸提20min；４℃离心机上离心2min，12200r/min；取上清液100μＬ，在真空浓缩仪上充分干燥；加入内标物，干燥；加入衍生试剂衍生化处理，等待进样分析。在其他因素相同条件下提取后经GC-MS检测，通过峰个数的变化程度，确定最佳提取液。2020/2/2626为增加样品的稳定性与挥发性，进样前需进行衍生化处理，衍生化试剂为盐酸甲氧胺溶于吡啶（40mg/mL)该试验设计５个时间段进行衍生处理，分别为30min,50min,70min,90min,110min以及５个温度10℃，20℃，30℃，40℃，50℃的单因素试验。根据相对峰面积和峰个数随衍生时间和温度的变化情况，找出最佳优化条件。实验方法2020/2/26272020/2/26282020/2/2629由GC-MS工作站得到的数据经过AMDIS软件分析，得到的谱库检索结果共84个化合物展望2020/2/2630与代谢组学的其他分析手段如LC-MS、CE-MS相比，GC-MS虽然较为成熟，但由于GC-MS分析样本中代谢物普遍需要衍生化预处理，造成多重峰、多重底物等现象，需要对其进一步深入研究。1)开发新型的衍生化试剂，使其与多个官能团发生衍生化反应，可获得重复性好的方法。2)此外，研发在线的衍生化方法，保证代谢物的硅烷化反应程度的完全，还可利用与代谢物结构/生理相似的标准品，模拟出相关代谢物潜在的影响，以提高分析的准确性。3)如何获得可参照的内标物实现所有代谢物的绝对定量分析，也将成为GC-MS应用于代谢组学中的研究重点。互联网上有关GC-MS的信息资源互联网上的搜索引擎和搜索网页首先，可以使用一些搜索引擎或搜索网页帮助检索，较常用的有一下几个搜索引擎和搜索网页：://://://://美国化学文摘服务中心美国国家医学图书馆medline在上述搜索引擎和搜索网页是那个可以很简单地键入英语关键词质谱（massspectrometry）很快可以找到有关网页。22