AAV病毒载体应用中的常见问题-重组-AAV-病毒的滴度测定

本元正阳基因技术股份有限公司国家高技术计划病毒基因载体研发基地重组AAV病毒的滴度测定目录一、重组病毒滴度表示形式二、点杂交方法测定重组AAV病毒滴度原理材料和方法三、用蛋白浓度推算重组AAV病毒滴度----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------一、重组病毒滴度表示形式重组病毒的滴度有多种表示形式，如cfu/ml,pfu/ml,,IU/ml,TU/ml,particles/ml，v.g/ml,DRP/ml等。这些滴度表示形式的不同主要是由于各种病毒载体的生物学特点不同，以及约定俗成的习惯造成的。为了便于比较，目前国际上越来越倾向于采用物理滴度(如particles/ml，v.g/ml,DRP/ml等)表示重组病毒的滴度。cfu:cloneformingunit的缩写，克隆形成单位。cfu/ml指1ml重组病毒液感染细胞能形成转导细胞克隆的数量。多用于反转录病毒载体如LN系列。由于该载体中有neo基因表达单位，用获得的重组病毒感染细胞后，可用G418来选择培养，通过计数G418抗性克隆数量来表示病毒滴度。用反转录病毒载体感染细胞不会引起细胞裂解性病变，所以不用pfu（plaqueformingunit）来表示滴度。pfu：plaqueformingunit的缩写，空斑形成单位。多用于腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等引起细胞裂解性病变的病毒载体。IU：infectionunit的缩写。感染单位。TU：transductionunit的缩写。转导单位。Particles/ml：每ml液体中含有的病毒颗粒数。也叫物理滴度。其中的病毒颗粒有可能是实心的，也有可能是缺损的或空心的。后者对转染是无效的。为了更好地表示有效滴度，有些病毒载体滴度在应用时采用了含有基因组的病毒颗粒的概念，从而将缺损的或空心的病毒颗粒排除在滴度之外。DRP/ml:DNaseresistantparticles/ml的缩写。见用于表示AAV病毒载体滴度。指每ml病毒液中含有能抵抗DNaseI消化的病毒颗粒数。主要用于排除病毒颗粒外的基因组DNA，即未被包入病毒粒子中的基因组DNA对滴度的影响。通常用点杂交（dot-blotting）方法来测定。地址：北京经济技术开发区永昌中路6号邮政编码：100176电话：[phone]传真：[phone]网址：：vectorgenomes/ml的缩写。常用于表示AAV病毒载体的滴度。是指每ml病毒液中含有的基因组拷贝数。通常用点杂交（dot-blotting）方法、QC-PCR方法、realtime-PCR方法来测定。通常在测定前对样品用DNaseI处理，因此该滴度表示方法一般指每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。二、点杂交方法测定重组AAV病毒滴度以下介绍本公司测定重组AAV2病毒（recombinantadeno-associatedvirus,rAAV2）的点杂交方法。探针由于目前本公司构建的各种重组AAV病毒大多采用CMV启动子，因此采用CMV启动子序列合成探针具有很好的通用性，即凡是含有CMV启动子的重组AAV病毒都可以用该探针测定病毒滴度。下图为重组AAV病毒基因组结构示意图。CMVTransgeneITRITR在这里我们列举了采用CMV启动子DNA为模板合成探针，通过点杂交方法检测病毒颗粒中CMV启动子的拷贝数来计算重组AAV病毒的滴度。如果重组AAV病毒中采用的是其它启动子，就不能用所述的CMV探针做点杂交。事实上，研究者可采用被包装的治疗基因序列为模板，按照本文介绍的方法合成相应的探针和进行滴度测定。点杂交方法测定rAAV滴度的原理应用点杂交方法测定的rAAV滴度的含义为每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。单位是v.g./ml。在测定方法中包含了用DNaseI消化病毒颗粒外DNA的步骤，因此，用本方法测定的滴度包含了DRP（DNaseIresistantparticles）的概念。用含有CMV启动子序列的质粒如pSNAVDNA作为rAAV滴度测定的标准品。用紫外分光光度法测定260nm波长的吸光度值（OD260）计算质粒DNA的含量。〔DNA〕=50×OD260×稀释倍数（ng/μl）。根据摩尔定律计算质粒DNA的拷贝数。将该质粒DNA按一定比例连续稀释成一系列确定浓度的DNA溶液，点于杂交膜上作为判定CMV拷贝数的标准。用CMV启动子序列为探针对膜进行杂交。通过比较杂交膜上待测的rAAV样品点与系列标准点的杂交信号的强弱，判断待测的rAAV地址：北京经济技术开发区永昌中路6号邮政编码：100176电话：[phone]传真：[phone]网址：的拷贝数（v.g），从而推算出rAAV滴度。作为标准品的质粒DNA应具有很高的纯度。用分光光度法检测OD260与OD280比值应为1.8~2.0。可用琼脂糖凝胶电泳法观察有无RNA存在。材料与方法材料地高辛DNA标记和检测试剂盒（Roche公司）CMV启动子引物DNaseI（SIGMA公司）标准质粒pSNAV（本公司产品）方法1、PCR方法探针标记以pSNAV质粒DNA为模板。CMV上游引物：5’-ATTTATATTGGCTCATGTC-3’CMV下游引物：5’-CTTATATAGACCTCCCACC-3’dNTP的组成为：1mMdATP,1mMdGTP,1mMdCTP,0.65mMdTTP,0.35mMDIG-11-dUTP。反应体系：10×Buffer5µldNTP1µl上游引物1µl下游引物：1µlTaq酶（5u/µl）1µlpSNAV质粒DNA100ng补ddH2O至总体积为50µl反应条件94℃，300s；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；--30cycles72℃，300s。PCR反应结束后，取1μl电泳检测PCR扩增效果，应看到一条特异的扩增带。向上述50μl的PCR反应液中加入5μl4mol/LLiCl和150μl预冷的无水乙醇，置于-70地址：北京经济技术开发区永昌中路6号邮政编码：100176电话：[phone]传真：[phone]网址：本元正阳基因技术股份有限公司国家高技术计划病毒基因载体研发基地℃30min或-20℃2h。于4℃以12000rpm离心10min，沉淀用70%乙醇洗涤。用20μlpH8.0的TE缓冲液重悬沉淀。至此探针标记和制备完毕。置-20℃保存备用。2、样品处理取10μl待检rAAV样品，加入2μl10×DNaseI缓冲液、7μlddH2O、1μlDNaseI，至总体积20μl。37℃孵育1h。3、标准质粒的配制将标准质粒pSNAVDNA用TE（pH8.0）稀释，使之浓度分别为8.2ng/μl，4.1ng/μl，2.05ng/μl，1.03ng/μl，0.52ng/μl，0.26ng/μl。4、将样品和上述稀释的标准质粒于100℃煮沸变性10min，立即置于冰水中。5、将变性后的样品和标准质粒各取1μl点于尼龙膜上，120℃烤膜30min。6、预杂交按100cm2膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。预杂交液组成：5×SSC1%（W/V）封阻试剂0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠0.02%（W/V）SDS膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在68℃预杂交4～5h。7、杂交去除预杂交液，换成杂交液（预杂交液中加入150ng/ml变性的探针DNA即构成杂交液）。其间膜不能干。于68℃杂交过夜（16～20h）。8、洗膜按100cm2膜用250ml洗膜液计算。在室温下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。在68℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，15min，2次。9、免疫测定配制溶液：缓冲液1：顺丁烯二酸(100mmol/L)；NaCl(150mmol/L)；pH7.5(20℃)缓冲液2：1%(W/V)封阻试剂，配制于缓冲液1中(封阻试剂不易溶解,因此应预早1h前配制此溶液，将试剂溶于50～70℃，此溶液保持混浊)。地址：北京经济技术开发区永昌中路6号邮政编码：100176电话：[phone]传真：[phone]网址：：Tris-HCl(100mmol/L)；NaCl(100mmol/L)；pH9.5(20℃)缓冲液4：Tris-HCl(10mmol/l)；EDTA(1mmol/L)；pH8.0(20℃)显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液和35μlBCIP溶液。显色过程：膜在缓冲液1中短暂洗涤（1～5min）。在适量缓冲液2中保温30min。再用缓冲液1短暂洗涤。用缓冲液2稀释抗体结合物（AP-DIG）至150U/L(1:5000)（稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h）。膜在适量稀释的抗体结合物溶液中保温30min。用适量缓冲液1洗膜，以除去未结合的抗体结合物，15min，2次。膜在缓冲液3中平衡2min。在黑暗条件下，膜与适量显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内，几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在2小时左右完成。显色时不可振荡或搅拌。用适量缓冲液4洗膜5min以终止反应。10、显色结果654321样品标准质粒11、rAAV滴度计算方法1）计算质粒（pSNAV）的分子量MW=2×质粒长度（碱基数）×碱基平均分子量=2×7015×320=4.576×1062）计算标准质粒对应的拷贝数如7.6ngpSNAV的拷贝数=7.6×10-9×6.02×1023/4.576×106=10×108地址：北京经济技术开发区永昌中路6号邮政编码：100176电话：[phone]传真：[phone]网址：质粒质量（ng）拷贝数17.610×10823.85.0×10831.92.5×10840.951.25×10850.480.625×10860.240.313×1083）结果判定比较样品与标准质粒的杂交信号强度，确定rAAV滴度。观察上述杂交结果，样品的信号与标准质粒5相近，因此：rAAV滴度(v.g./ml)=对应的拷贝数×2×1000=0.625×108×2×1000=1.25×1011v.g./ml12、方法评价由于结果判定取决于样品与标准质粒的杂交信号的强弱比较，因此点杂交方法测定rAAV病毒滴度得到的结果并不是精确的，而是一个近似值，有一定的误差范围。三、用蛋白浓度推算重组AAV病毒滴度对于纯度为100%的野生型AAV2病毒，有一种通过蛋白浓度计算病毒物理滴度的经验公式：病毒滴度（particles/ml）=蛋白浓度（mg/ml）×1.33×1014对于纯化的rAAV病毒液，可以用这种方法推算其物理滴度。例如用BCA蛋白测定方法（PIERCE公司产品）测得纯化的rAAV2/GFP病毒液的蛋白浓度为0.3mg/ml，则可以推算其物理滴度为0.3×1.33×1014=4×1013particles/ml。然而，我们的研究发现，这种方法推算出的物理滴度值与点杂交法测定的滴度值之比一般为5~10。值得注意的是，只有rAAV的纯度接近100%时才能用蛋白浓度来粗略估算的物理滴度，并且这种滴度概念中未排除空心病毒颗粒和不完整的病毒颗粒。（质检部）地址：北京经