细胞破碎

细胞破碎主讲人：董冰雪细胞破碎就是采用物理、化学的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。概念细胞破碎机理图革兰氏阳性细菌的细胞壁结构革兰氏阳性（G+）细菌的细胞壁具有较厚（30-40nm）而致密的肽聚糖层，多达20层磷壁酸：是革兰氏阳性菌的特有的成分，可加强肽聚糖的结构。革兰氏阴性细菌的细胞壁革兰氏阴性细菌的外膜壁膜间隙O-特异多糖(O-polysaccharide)核心多糖(core-polysaccharide)蛋白质类脂A(LipidA)孔蛋白(脂多糖)磷脂分子脂蛋白微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质(6-8%）脂类(8.5-13.5%)多聚糖（80-90%）脂类蛋白质细胞壁的结构和特点细胞破碎的阻力细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁细胞的破影响因素物理破碎时影响因素：细胞的大小形状细胞壁的厚度聚合物的交联程度酶法和化学法溶解细胞影响因素：组成结构不同细胞破碎的难易程度植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。细胞破碎目标产物的选择性释放选择性释放目标产物，使其他物质尽量少地释放出来，并尽量降低细胞的破碎程度，对下游分离纯化有利。细胞破碎方法（按是否使用外加作用力）分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活分类作用机理适应性物理破碎高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用反复冻融法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜的渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合化学破碎酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差细胞破碎的方法（按细胞所受作用）高压匀浆法珠磨法超声破碎法渗透压法反复冻融法干燥法X-press法1.物理破碎高压匀浆法（High-pressurehomogenization）——大规模细胞破碎的常用方法原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。高压匀浆器压力(工业生产中常用55～70MPa的压力)循环操作次数(多次循环的操作方法)温度高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:不宜采用高压匀浆法的微生物：易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。珠磨法（Beadmill）①工作原理：卧式WSK卧式高效全能珠磨机ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机②影响细胞破碎的因素b.珠体的装量a.珠体的大小c.搅拌速度d.操作温度e.被处理细胞的特性实验室规模，珠径0.2mm，工业规模珠径大于0.4mm80～90％适当5～40℃珠磨法的破碎率一般控制在80％以下撞击破碎原理：细胞冷冻后成为刚性球体，再进行高速撞击而破碎特点：细胞破碎均匀；可通过调节载气压力控制细胞破碎程度；适用于细胞器（如线粒体、叶绿体）的回收。其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。超声破碎法（Ultrasonication）超生波破碎细胞时的频率一般为15～20kHz，功率为100～250W，可分为槽式和探头直接插入介质式两种型式。影响超生波破碎的因素声强、频率、破碎时间、介质的离子强度、pH菌体的浓度和种类。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20％左右。超声波应用超声波破碎法在实验室和小规模生产中应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷却到0～5℃，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行冷却。另外，超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。可以通过添加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。渗透压冲击法（Osmoticpressure）仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。反复冻融法缺点：适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。使细胞膜结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。（6）干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25～30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌；冷冻干燥适用于较不稳定的物质。此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而破碎。（7）X-press法该法主要用于实验室，具有使用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。不适用于对冷冻敏感的物质。酶溶法化学试剂破碎法外加酶法自溶法表面活性物质EDTA螯合剂有机溶剂变性剂2.化学破碎（Chemicalpermeation）（1）酶溶法（EnzymaticLysis）①外加酶法常用的溶酶G+溶菌酶、适量抑制剂G-溶菌酶、EDTA放线菌溶菌酶酵母菌β-葡聚糖酶霉菌几丁质酶、植物纤维素酶、半纤维素酶细胞壁溶解酶是几种酶的复合物选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。酶溶法的优点：酶溶法的缺点：缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。（2）自溶法（Autolysis）诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。（2）化学试剂破碎法（Chemicalpermeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。如TritonX-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。EDTA螯合剂能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。有机溶剂变性剂盐酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%有些化学试剂有毒。化学法的优点：缺点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。细胞破碎效果的检查破碎率定义:被破碎的细胞的数量占原始细胞数量的百分数，即其中N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接测定法、目的产物测定法和测定导电率得到。1.直接测定法显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。方法：样本适当稀释后，通过平板计数技术或在血球计数板上用显微镜观察来实现染色细胞的技术。平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，误差大；细胞聚集时，不利计数。2.目标产物测定法Rm：理论最大值，R：实验测得值。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。3.测定导电率细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。导电率的大小取决于微生物的种类、处理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液中原电介质的含量等，因此，正式测定前，应预先用其它方法测定标准曲线。选择破碎方法时，需要考虑下列因素：选择破碎方法的依据1.处理量的大小2.细胞壁的强度和结构3.目标产物对破碎条件的敏感性4.破碎后固－液分离的难易程度适宜的操作条件应从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面权衡。破碎技术的发展方向1.多种破碎方法相结合2.与上游技术相结合培养过程控制3.与下游技术相结合寄主细胞的选择包含体的组成耐高温产品的基因表达克隆噬菌体溶解基因一、细胞壁结构和特点三、细胞破碎率效果的检验二、细胞破碎的方法四、选择破碎方法的依据五、破碎技术的发展方向小结思考题1、简述常用细胞破碎方法的原理、特点和适用范围。2、简述破碎技术与上下游过程相结合提高破碎效率的机理