结核病实验室诊断

结核病实验室涂片镜检技术王甦民北京结核病控制研究所2010年12月结核病基本情况：（1）结核病是一个古老的疾病，至今仍然严重威胁着人类健康。近十几年来，由于结核菌的耐药性、HIV/TB双重感染移民（流动人口）问题使全球结核病控制工作面临严重挑战。全球结核病告急据世界卫生组织估计目前全球约有：1/3人口（20亿）感染结核菌；2000万结核病人；每年有800万-1000万新发病例；每年300万人死于结核病；我国结核病现状我国的结核病疫情依然十分严重，是世界上结核病患病率最高的22个国家之一。是耐药结核病最多的全球27个国家之一。每年新登记的结核病患者约130万。我国结核病现状2000年全国结核病流行病学抽样调查初步结果显示：–全国受结核菌感染人口超过5.6亿；–全国现有传染性肺结核病人200万，传染性肺结核患病率为157.8/10万。–结核病死亡率为9.8/10万，在各种死亡原因中占第11位。–结核菌耐药率：27.8%，初始耐药率18.6%，获得性耐药率：46.5%。INH:17.6%，SM：17.3%，RFP：16.6%，EMB：1.5%，MDR：10.7%。–非结核分枝杆菌感染：11%我国结核病现状—我国历次流调疫情时间肺结核患病率涂（+）患病率肺结核病人数涂（+）病人数1979717/10万187/10万690000018000001984/85550/10万156/10万570000016200001990523/10万134/10万593000015100002000367/10万122/10万50000001500000结核病细菌学检查的重要作用是结核病临床诊断和治疗的重要依据是直接发现病原菌的诊断方法，比影象学、免疫学等检查具有更高的特异性是确定、调整化疗方案的重要依据是国家结核病控制规划（NTP）的重要组成部分是发现传染源的最主要途径和手段是考核疗效、评价防治效果的可靠指标分枝杆菌生物学基础概述结核分枝杆菌是1882年郭霍（RobertKoch）从肺结核病人痰标本中发现。是人类结核病的主要病原菌。分类•结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚多，目前已命名的有200多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。概述分枝杆菌呈分支状生长，营养要求比普通细菌高，是一种生长缓慢的革兰氏阳性杆菌。经石炭酸复红染液着色后，不被盐酸酒精脱色，故称此类细菌为抗酸菌。分枝杆菌分类类别Rubyun分群对人致病的分枝杆菌缓结核分枝杆菌复合群人型、牛型、非洲型慢非结核分枝杆菌I群堪萨斯、海、猿生非结核分枝杆菌II群瘰疬长非结核分枝杆菌III群鸟-胞内、蟾快速生长非结核分枝杆菌IV群偶发、龟结核分枝杆菌结构结核分枝杆菌组成：细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质细胞壁厚度为10~35nm，较一般细菌的细胞壁厚。含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。功能：•保护细菌的固有形态•抵抗酸碱物质及宿主细胞对细菌的破坏和杀伤如果细胞壁有缺陷，细菌只能在高渗环境下生存，则称此类细菌为L型细菌。细胞膜细胞壁内层围绕于细胞质外的富于弹性的半透膜。主要成分是脂类（磷脂）和蛋白质。功能：–细菌与外界环境进行物质交换–在细胞内一系列代谢活动中起重要作用菌体成分•脂类•多糖•蛋白质•核酸•盐类脂类（1）•结核菌体脂类含量比其他细菌高，占细胞壁干重的60％，是引起结核病特征性变化与表现的物质基础。•脂质含量与细菌毒力相关，毒力强的Mtb含脂最高。•脂质只要有磷脂、脂肪酸、蜡质等成分，多与蛋白质、多糖以结合形式存在。脂类（2）•磷脂：刺激机体单核细胞增生，增强菌体成分诱导机体致敏作用。•索状因子：与Mtb毒力密切相关。•硫脂•蜡质：占脂质总量48％，分A、B、C、D。•结核菌酸：促进机体形成结核结节。•分支菌酸：为结核菌菌体的重要成分，与结核菌的抗酸性有关。多糖•由阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等组成。•多以脂类、蛋白质和核酸等结合形式存在。•是免疫反应的重要抗原物质。蛋白质•Mtb含多种蛋白质组分，由不同菌体蛋白及活菌在分泌过程中分泌于细胞外的多种蛋白组成。•结核菌的主要抗原性物质。•结核菌素、PPD为多种蛋白的复合抗原，可刺激机体免疫应答。核酸•RNA含量比DNA高4－5倍。•RNA分布于细胞质内，DNA存在于细胞核物质中。•DNA是遗传物质，将遗传信息传给子代，并指导RNA的合成。•RNA是蛋白质和其他细胞成分合成必须的物质。结核分枝杆菌基因组•结核分枝杆菌DNA中约含4000个基因组。•结核分枝杆菌为2.5×109道尔顿,卡介苗株为2.8×109道尔顿•结核分枝杆菌H37Rv基因组全序列共含4.4×106碱基对，平均鸟嘌呤+胞嘧啶含量（G＋C）为65.6％。盐类•钙、钾、镁、铁、磷等，约占菌体成分的6％。营养与发育•结核菌是需氧菌，但在含有比较低氧的环境下也能生存，比如骨结核，淋巴结核。•在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。•结核菌生长的适宜温度和人体相近为370C•结核菌生长所必需的元素有氧、碳、氮、氢、磷、钾、镁等。结核分枝杆菌形态结核菌是兼性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能力；形状：0.3-0.6×1-4微米的细长杆状，直或稍弯，镜下常堆积成团、成束、排列杂乱无章，也有呈串珠样、链状、索状者。革兰氏染色阳性，萋-尼氏染色镜下的抗酸杆菌为淡兰色背景下的红色或粉红色细长杆菌。荧光染色镜下的抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光。抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学基础是分枝菌属的细胞壁脂质含量较高，并含有大量分枝菌酸。抗酸性与细菌细胞壁的完整性关系密切，若菌体自溶（如标本保存时间过长、温度过高）、结核菌的异型相（如：L-型菌、干酪或脓液中的结核菌）可能失去抗酸性。抗酸性生长特性生长适宜温度37C，PH6.8-7.2。营养要求较高。在常用的罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透明。结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10多小时，根据接种菌量的多少，一般10-30天肉眼可见菌落生长。结核病的诊断诊断发展阶段：经验性、X线影像，細菌学诊断、免疫学（细胞、体液）诊断、分子生物学诊断。控制结核病的流行，诊断是所有措施中最为关键的一步。实验室检查•结核病实验室检查包括细菌学检查以及近年来在分子生物学和免疫学等领域建立的检测新技术。•细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。•检测新技术为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来新的希望。结核病细菌学诊断结核病细菌实验室布局原则•1、结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用，最好为P3级实验室；•2、培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行；•3、基层只从事涂片镜检的实验室只拥有一间独立房舍的情况下，相对洁净区（镜检区、登记区）与污染区（涂片、染色区）要有明显区分。基层镜实验室布局范例染色池收集标本用的桌子工作台采光用窗户（固定）实验室门试剂柜显微镜记录用的桌子可以开关的窗户废弃标本和污染物的处理废弃标本、痰盒和污染物均须经高压蒸汽灭菌后方能丢弃或清洗；如需焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚化不彻底或暴露焚烧是危险的；专业化处理试验操作工作面应以3%石炭酸或其他可靠的消毒液擦拭，再用紫外线灭菌灯照射2小时主要方法1、痰涂片抗酸染色、镜检技术2、分枝杆菌分离培养技术3、分枝杆菌快速培养技术4、药物敏感性实验技术5、分枝杆菌菌种鉴定技术痰标本采集(一)容器：采用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径4cm，高度2cm）。容器上应清晰标注患者姓名、病例号、检查项目。痰标本采集(二)按采集的时间，可将标本分为三类即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液；晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液；夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液；合格的痰标本：应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。包括干酪痰、粘液痰和血痰。对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本性状、质量对相应检查项目的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如患者识字，可提供宣教材料。痰标本采集(三)如何正确留痰查痰对于结核病的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是否痰中带菌。如果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有传染性，应该及时遵医嘱治疗。送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照下列要求和方法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取1～2口痰，请不要将1口痰分开放到2或3个痰盒中。•正确的咳痰方法：1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并稍加力。3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续咳嗽三声。4、停止咳嗽后，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。•*注意：部分人如果忽然深吸气容易诱发咳嗽，您可以尝试缓慢或分几次吸气，争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动作的连贯性，一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁。这样震动支气管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。患者留取的痰标本，应由检验人员或经过培训的专人目视检查标本性状质量(特别是用于初次诊断的痰标本)：标本量一般在3～5ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；唾液为不合格标本。确定诊断检查时痰标本不合格者，医务人员应予以进一步指导并要求其重新送检。进行AFB涂片检查时应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。痰标本采集(四)痰标本采集(五)注意：由于当患者咳嗽、咳痰时，易产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。1、干酪痰：标本外观以黄色(或奶酪色)、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB的检出率较高。痰标本性状(一)痰标本性状(二)2、血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标本易干扰AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。3、粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞(细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅的纤毛)，伴有少量肺上皮脱落细胞(多数形态不规则、细胞核较小且着色较细胞质深，核质比大于1:3)、脓性炎症细胞(卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比低于1:1)、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB检出率较唾液高。痰标本性状(三)痰标本性状(四)4、唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞(形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于1:2)和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本。细菌学常规检查—直接涂片法操作流程涂痰膜自然干燥复红加热初染5分钟自然干燥镜检流水冲洗美兰复染30秒盐酸酒精脱色流水冲洗流水冲洗细菌学常规检查—直接涂片法显微镜检报告方式：0条/300视野：萋-尼氏抗酸杆菌阴性1-8条/300视野：实报菌数3-9条/100视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性（+）1-9条/10视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性（