高级生物化学-DNA测序

DNA测序及基因组测序策略结构基因组学的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱的完成，人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序均取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高，大大推进了大规模DNA测序的进程。一、DNA测序的基本方法链终止法测序化学降解法测序自动化测序非常规DNA测序1、链终止法测序(thechainterminationmethod)1）基本原理:1977年Sanger提出了“终止法”。其反应体系包含单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶，分四组进行，每组按一定比例加入一种2’，3’双脱氧核苷三磷酸，它能随机掺入合成的DNA链，一旦掺入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA序列。2）技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列A克隆于质粒中DNA→用碱或热变性BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNADPCR产生单链DNAA高酶活性B无5’→3´外切酶活性C无3´→5´外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基2化学降解法测序（Maxam和Gibert于1977年发明）1）基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.2）技术路线将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,读取DNA的核苷酸顺序①先用限制性内切酶把DNA切成10—200bp的测序材料；②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸；③在5′OH端标记32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；④标记片段变性为单链；⑤用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链，紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段；⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。3）Maxam-Gilbert法所用的化学技术碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶●4组特异反应●测序流程3自动化测序1）基本原理与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddTTP标记绿色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.2）基本流程3）自动化测序结果4、非常规测序及未来测序方法1）光点测序脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA3’-末端时会释放1个焦磷酸(PPi),焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,如加入的核苷酸结合则反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;如核苷酸未结合则反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,按此规律来测定DNA序列.2）单分子测序法(single-moleculeseguencing)单分子测序法是美国LosAlames国家实验室(LANL)发展的一种通过检测标记在单个分子上的荧光进行DNA快速测序的方法。模板DNA分子首先通过酶法修饰或合成，使不同的荧光素标记不同的碱基，然后，用两个激光束(或称激光镊子lasertweezer)夹住标记的DNA分子，将其置于液流系统，从被固定的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸，通过单分子荧光探测器检测液流中切下的标记核苷酸，再根据检测到的信号顺序确定DNA顺序。3）DNA芯片测序基本原理将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序.1ATACGTTA2GTTAGATC3ACGTTAGA4CGTTAGAT5GTTAGATCDNA样品TATGCAATCTAG与基因芯片上65,000种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1ATACGTTA3TACGTTAG4ACGTTAGA2CGTTAGAT5GTTAGATC3TACGTTAG4ACGTTAGA2CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG利用基因芯片进行杂交测序的原理新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅助激光吸收技术使利用质谱法分析大片段DNA成为可能。其中四极离子捕获效果更好。Fourier转型质谱或飞行时间质谱可进行极为敏感的DNA测序。4)质谱法(massspectrometry)●电喷雾离子化技术●基质辅助激光吸收技术DNAsequenceanalysisbyMALDImassSpectrometry——FinnKirpekar，etal,2554–2559,NucleicAcidsResearch,1998,Vol.26,No.ABSTRACT:ConventionalDNAsequencingisbasedongelelectrophoreticseparationofthesequencingproducts.Gelcastingandelectrophoresisarethetimelimitingsteps,andthegelseparationisoccasionallyimperfectduetoaberrantmobilityofcertainfragments,leadingtoerroneoussequencedetermination.Furthermore,illegitimatelyterminatedproductsfrequentlycannotbedistinguishedfromcorrectlyterminatedones,aphenomenonthatalsoobscuresdatainterpretation.InthepresentworktheuseofMALDImassspectrometryforsequencingofDNAamplifiedfromclinicalsamplesisimplemented.TheunambiguousandfastidentificationofdeletionsandsubstitutionsinDNAamplifiedfromheterozygouscarriersrealisticallysuggestMALDImassspectrometryasafuturealternativetoconventionalsequencingproceduresforhighthroughputscreeningformutations.UniquefeaturesofthemethodaredemonstratedbysequencingaDNAfragmentthatcouldnotbesequencedconventionallybecauseofgelelectrophoreticbandcompressionandthepresenceofmultiplenon-specificterminationproducts.TakingadvantageoftheaccuratemassinformationprovidedbyMALDImassspectrometry,thesequencewasdeduced,andthenatureofthenon-specificterminationcouldbedetermined.ThemethoddescribedhereincreasesthefidelityinDNAsequencing,isfast,compatiblewithstandardDNAsequencingprocedures,andamenabletoautomation.5）原子探针显微镜测序法(atomicprobemicroscopy)扫描隧道显微镜（STM）和原子力显微镜（AFM）的发展使直接检测DNA分子结构成为可能。其中STM是用一个直接大约相当于一个原子大小的导电探针扫描DNA分子表面，通过检测探针和DNA分子表面之间形成的隧道电流来确定DNA分子的三维形状。STM还可分辩单链DNA分子上的单个核苷酸。通过STM可观察双链DNA分子的双螺旋结构以及单个碱基对。AFM通过检测扫描探针和分子表面间的作用力来确定分子表面形状。虽然原子探针显微镜为直接描述DNA组成提供了美好前景，但就目前来说，如何定位DNA分子以便于检测是一个难题。●Anoverviewofcurrentandemergingtechnologiesforgenomicsequencing.——NeilHall.J.Exp.Biol.,May2007;210:1518-1525Sequencingcanbeclassifiedintofourmainstrategies:invitrocloning,invivocloning,amplificationandmassspectrometry,andsingle-moleculeapproaches.InvivocloningfollowedbySangersequencingistheworkhorsemethodofmostcurrentgenomesequencingprojects.Themassspectrometryandsingle-moleculeapproachesarestilleitherveryspecializedorinthedevelopmentalstages,althoughmassspectrometrymethodssuchastheMassArraymethodiscommonlyusedforsinglenucleotidepolymorphism(SNP)analysis(Jurinkeetal.,2002).Theinvitrocloningtechnologiescanbefurtherdividedintomethodsthatemploysequencingbysynthesis,suchasthe454andSolexamethods,orthosethatusehybridizationandligationofoligonucleotides,suchasMPSS(massivelyparallelsignaturesequencing)andpolonymethods.1定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析。二、基因组测序策略与序列的组装1）传统方法传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析。2）新方法近年来以下几种方法得到发展：（1）引物引导的序列分析：第一轮DNA分析以载体的通用引物进行酶法测序，接下来每一轮测序反应的引物由上一轮测序反应所获得的DNA片段末端序列确定，这样通过“行走”便可进行大规模测序。最近有人主张建立引物文库以弥补每次“行走”均需进行引物合成的不足，计算表明，4000种小引物便可满足大规模测序的需要