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第四章微生物的营养微生物的营养要求培养基营养物质进入细胞微生物的营养营养(Nutrition)：是指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。营养物质(nutrient)：那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。第一节微生物的营养要求微生物细胞的化学组成营养物质及其生理功能微生物的营养类型一、微生物细胞的化学组成1.化学元素主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等，而前六种主要元素可占细菌细胞干重的97%。微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。2.化学成分及其分析各种化学元素主要以有机物、无机物和水的形式存在于细胞中。有机物主要包括蛋白质、糖类、脂类、核酸以及它们的降解产物和一些代谢产物等物质。有机物对细胞有机物成分的分析通常采取两种方式：用化学方法直接抽提细胞内的各种有机成分，然后加以定性和定量分析。先将细胞破碎，然后获得不同的亚显微结构，再分析这些结构的化学成分。无机物灰分：分析细胞无机成分时一般将干细胞在高温炉（550℃）中焚烧成灰，所得到的灰分物质是各种无机元素的氧化物，称为灰分。采用无机化学常规分析法可定量分析出灰分中各种无机元素的含量。水水是细胞维持正常生命活动所必不可少的，一般可占细胞重量的70~90%。湿重：将细胞表面所吸附的水分除去后称量所得重量。一般以单位培养液中所含细胞重量表示。干重：采用高温（105℃）烘干、低温真空干燥和红外线快速烘干等方法将细胞干燥至恒重即为干重。二、营养物质及其生理功能微生物的营养物质主要有五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。1.碳源碳源：是在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质。碳可占一般细菌细胞干重的一半。微生物利用碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良好碳源和能源物质，但微生物对不同糖类物质的利用也有差别，可分为速效碳源和迟效碳源。碳源目前在微生物工业发酵中所利用的碳源物质主要是单糖、饴糖、糖蜜、淀粉、麸皮、米糠等。代粮发酵：以自然界中广泛存在的纤维素作为碳源和能源物质来培养微生物。微生物利用的碳源物质主要有糖类、有机酸、醇、脂类、烃、CO2及碳酸盐等。最适碳源糖醇有机酸脂类碳源功能C素构成细胞及代谢产物的骨架C素是大多数微生物代谢所需的能量来源2.氮源氮源：凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养物质，称为氮源。能够被微生物利用的氮源物质包括：蛋白质、胨、肽、氨基酸、铵盐、硝酸盐、尿素、分子氮、嘌吟、嘧啶、酰胺、氰化物等。氮源氮源种类分子态氮：固氮微生物以分子氮为唯一氮源无机态氮：硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用有机态氮：蛋白质及其降解产物a速效氮源：实验室常用牛肉膏、蛋白质、酵母膏做氮源b迟效氮源：生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等。为微生物提供合成细胞物质代谢产物的原料，氮源一般不做能源，只有硝化细菌利用铵盐，亚硝酸盐作氮源，同时也作能源。氮源功能微生物对氮源的利用具有选择性，有速效氮源（蛋白质降解物）和迟效氮源（大分子蛋白质）之分，前者利于菌体生长，后者利于代谢产物的形成，故在生产上有时需要将两者按一定比例制成混合氮源。氮源氮源人类和动物需要供给氨基酸、蛋白质，而这些营养成分往往是它们食物或饲料中较缺少的，故为了补充氨基酸营养，绿色植物提供一部分，大部分利用氨基酸异养型微生物，让它们将廉价的尿素、铵盐、硝酸盐或N2转变成菌体蛋白质（食用菌、氨基酸等）以丰富人类的食物资源。3.无机盐构成微生物细胞的组成成分调解微生物细胞的渗透压，pH和氧化还原电位有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生物的能源构成酶活性基的组成成分，维持E活性。Mg、Ca、K是多种E的激活剂无机盐大量元素：生长所需浓度为10-3~10-4mol/L的元素微量元素：生长所需浓度为10-6~10-8mol/L的元素4.生长因子生长因子：通常指那些微生物生长所必需而且需要量很少，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。一般来自动、植物体。生长因子(growthfactor)微生物在生长过程中不能自已合成的生长繁殖必需的需要量较少的外界加入的有机物是生长因子谱：维生素氨基酸嘌呤(或嘧啶)提供方式：原料：酵母膏、玉米浆、肝浸出液、麦芽汁、新鲜动植物组织维生素有的微生物自己不能合成维生素，需要外加，主要是B族维生素、硫胺素、叶酸、泛酸、核黄素等，如生产味精需加生物素（VH）。维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢。氨基酸有些微生物自己不能合成某种AA，必须给予补充，如赖AA发酵所用的黄色短杆菌不能合成环丝AA，为环丝AA缺陷型菌株，在培养基中必须添加含环丝AA的氮源。如豆饼水解液或毛发水解液等。碱基嘧啶和嘌呤是核酸和辅酶的重要组分，是许多微生物必须的生长因素。有些微生物不仅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能将补充的嘧啶和嘌呤结合在核苷酸上，还必须供给核苷酸，有的菌需补充卟啉或其衍生物，还有的菌需供给（低碳）脂肪酸等。5.水水是生物生长必不可少的。微生物细胞含水约占细胞鲜重的70~90％，水作用是多方面的。水在细胞中的生理功能主要有：起到溶剂与运输介质的作用。参与细胞内一系列化学反应。蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象。因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，从而有效地控制细胞内温度的变化。保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素。微生物通过水合作用和脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、微管、鞭毛及病毒颗粒的组装与解离。水活度：在相同的温度、压力下，溶液中水的蒸汽压和纯水蒸汽压之比。P溶液P水aw=细菌酵母菌霉菌、放线菌耐盐菌0.9~0.990.880.80.76三、微生物的营养类型根据碳源、能源及电子供体性质的不同，可将绝大部分微生物分为光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型、化能无机自养型四种类型。微生物的营养类型微生物的营养类型自养微生物完全在无机环境中生存，以CO2、碳酸盐为碳源，以铵盐和硝酸盐为氮源来合成细胞质的微生物称为自养微生物。光能自养微生物可在完全无机的环境中生长，以CO2为碳源，光做能源，无机物为供H体还原CO2合成细胞有机物质的微生物叫光能自养微生物。化能自养微生物在完全无机的环境中生长发育，以无机化合物氧化为时释放的能量为能源，以CO2或碳盐为碳源，合成细胞物质的微生物叫化能自养微生物。这类细菌包括硫细菌、硝化细菌、H细菌、铁细菌等，硫细菌和硝化细菌与生产密切相关。异养微生物（有机营养型）以含碳有机物为碳源，含氮有机物或无机物为氮源，合成细胞物质，称为异养微生物。这类微生物具有光合色素。能利用光做能源，以有机化合物为供H体，还原CO2，合成细胞物质的微生物，称光能异养微生物。光能异养微生物能利用CO2，但必须在有机物存在的条件下，才能生长，人工培养还需供给生长因素。目前已用这类微生物，如红螺菌来净化高浓度有机废水，这对处理污水、净化环境，很有发展前途。光能异养微生物这类微生物以有机化合物为碳源，利用有机化合物氧化过程中产生的能量为能源，以有机或无机含氮化合物为氮源，合成细胞物质。这类微生物称为化能异养微生物。由于栖息场所和摄取养料不同，可将异养微生物分为腐生型和寄生型两大类。腐生型：利用无生命的有机物获得营养物质。寄生型：从活的寄生体内获取营养物质，如病毒。中间类型：兼性腐生或兼性寄生，如结核杆地菌、痢疾杆菌就是兼性寄生菌。化能异养微生物（化能有机营养型）第二节培养基培养基：是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。科研生产中培养微生物都需要配制培养基。一、配制培养基的原则选择适宜的营养物质营养物质浓度及配比合适控制微生物的培养条件pH值：调节氧和CO2的浓度调节培养基的渗透压原料来源的选择灭菌处理1.选择适宜的营养物质何菌？何产物？何种规模？自养菌：不能含有有机物异养菌：供给有机物细菌：牛肉膏蛋白胨培养基放线菌：高氏一号培养基酵母菌：麦芽汁培养基霉菌：查氏培养基主流代谢支流代谢实验室培养种子罐培养发酵罐培养2.营养物质浓度及配比合适各营养元素之间的比例要协调H2OCNP、SMn、Co生长因子110-210-310-410-510-6C/N比率：在微生物的培养基中所含的碳源中碳原子摩尔数与氮原子摩尔数之比。细菌、酵母菌C/N=5/1霉菌、放线菌C/N=10/1氮源过多：菌体生长过旺，不利于积累代谢产物氮源不足：菌体繁殖受到抑制，代谢产物积累(1)控制pH值细菌：7.0~7.5放线菌：7.0~7.5霉菌：4.0~5.8酵母菌：4.0~5.83.控制微生物的培养条件(2)培养基pH值调节方式缓冲液内源性备用碱:CaCO3外加调节：直接加酸、碱(工业适用)KH2PO4K2HPO4等克分子量，pH值为6.8(3)调节O2和CO2浓度好氧菌：空气、通气厌氧菌：加入还原剂等二、培养基的类型及应用按成分不同划分根据物理状态划分按用途划分1.按成分不同划分天然培养基合成培养基天然培养基如牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基。天然培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。合成培养基是由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基。如高氏Ⅰ号培养基和查氏培养基。重复性较好，但成本较高，微生物在其中生长较慢，一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。2.根据物理状态划分根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。固体培养基半固体培养基液体培养基按培养基物理状态加凝固剂：明胶、硅胶、琼脂1.5~2%天然固体：米糠、木屑、马铃薯块滤膜：微孔醋酸纤维薄膜凝固剂为0.5%左右无凝固剂无营养、无分解能力，融点96℃，凝点40℃琼脂是由红藻门石花菜、江蓠等藻类中提取的胶体多糖。琼脂的化学成分为半乳糖和半乳糖醛酸的聚合物，熔点96℃，凝固点是40~45℃。琼脂培养基可反复溶化凝固而不改变性质。绝大多数微生物不水解琼脂。琼脂固体培养基理想的凝固剂应具备以下条件：不被所培养的微生物分解利用。在微生物生长的温度范围内保持固体状态。凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利于微生物的生长。凝固剂对所培养的微生物无毒害作用。凝固剂在灭菌过程中不会被破坏。透明度好，粘着力强。配制方便且价格低廉。凝固剂常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。半固体培养基半固体培养基：培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2%~0.7%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征和分类鉴定等。液体培养基液体培养基：培养基中不加凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。3.按用途划分基础培养基加富培养基鉴别培养基选择培养基保藏菌种培养基基础培养基基础培养基：是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在基础培养基中加入所需营养物质。加富培养基加富培养基：也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基，这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，如培养百日咳博德氏菌需要含有血液的加富培养基。加富培养基还可以用来富集和分离某种微生物，这是因为加富培