实验十一 显微镜直接计数

实验十一显微镜直接计数法目的要求了解血球计数板的构造；学习计数原理和计数方法；掌握显微镜下直接计数的技能。基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，即将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积一定（0.1㎜3），所以可根据显微镜下观察到的微生物数计算出单位体积内微生物数目。由于此法所得的是活菌和死菌的总数，故又称总菌计数法是一种常用的微生物计数方法。1、血球计数板结构血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上由4条槽构成3个平台。中间的平台又被一短横槽分隔成两半，每半上面各有一个平台。每个平台上刻有方格网，每个方格网分成9个大方格，中间的大方格就是计数区。计数板结构计数区计数区的刻度有两种：一种是大方格分为25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。2、计数区血球计数板正面结构图计数室放大图****#####16×25规格计数板25×16规格计数板计数区边长为1mm，则计数区的面积为l×1＝1mm2，盖上盖玻片后计数区高度为0.1mm，所以一个计数区的体积为l×0.1＝0.1mm3。3、计数区容积4、计数方法通常数5个中方格中的总菌数A，若菌液的稀释倍数为B，则1ml菌液中：(1)25个中方格的计数板计算公式(2)16个中方格的计数板计算公式）（个总菌数mlBABA/50000102554）（个总菌数mlBAB/4000010164A45、直接计数法的特点优点：直观、快速、操作简单缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；实验器材活材料：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）斜面或培养液。器材：显微镜、血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。实验步骤1、稀释用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液。2、镜检计数室加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物，则需清洗后才能进行计数。3、加样取洁净的血球计数板一块，盖上盖玻片。将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘滴入一小滴，让菌液利用液体的表面张力充满计数区。4、显微镜计数将计数板置显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数，视野调暗。5、清洗血球计数板计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。注意事项计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角（即100小格）中的菌体进行计数。对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。对于压线酵母菌，按照数上线和右线的原则计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。出芽菌计数实验报告将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。各中方格中菌数二室12345AB菌数/ml平均值第一室1第二室1思考题根据你的实验体会，请说明用血球计数板计数时，哪些步骤易造成误差？应如何减少误差，力求准确？实验步骤1、取美蓝染色液一滴，置于载玻片中央。2、用滴管吸取少许菌悬液，加一滴至染色液中，染色3分钟。3、用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，再慢慢放下盖在菌液上，尽量避免产生气泡。4、先用低倍镜再用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死、活细胞。5、染色半小时后，再观察一下死、活细胞数目是否增加。1、稀释用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液。2、镜检计数室加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物，则需清洗后才能进行计数。3、加样取洁净的血球计数板一块，盖上盖玻片。将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘滴入一小滴，让菌液利用液体的表面张力充满计数区。4、显微镜计数将计数板置显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数，视野调暗。5、清洗血球计数板计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。