电生理研究方法

第二章心肌电生理学研究方法MethodologyofMyocardiumElectrophysiologicalResearch电生理学技术的发展1825年电流计发明与应用1922年电子管放大器和阴极射线示波器问世20世纪40年代微电极技术产生动作电位的钠学说20世纪50年代电压钳技术产生20世纪70年代膜片钳技术谢灵顿(Sherrington)（1857-1952）英国神经生物学家。发现中枢神经反射活动规律艾德里安(Adrian)（1889-1977）英国生理学家。阐明动作电位及其传导规律1932年获诺贝尔奖厄兰格(Erlanger)（1874-1965）（美）两人合作发明了阴极示波器，并研究了神经纤维的功能加塞(Gasser)（1888-1963）（美）1944年获诺贝尔奖Bernstein膜学说1902年，Bernstein提出生物电发生的膜学说：“神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透性，而对较大的阳离子和阴离子则均无通透性，因此由于细胞内外钾离子分布不均匀，在膜两侧就形成一个电位差，此即静息电位，神经冲动到来时，膜变为无选择通透的膜，静息电位消失，动作电位因而产生。”离子学说（动作电位的钠学说）1940年前后，由于Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨轴突上发现动作电位大于静息电位的事实，Bernstein膜学说受到了有力的打击。以后的研究证实，Bernstein膜学说对于离子通透性的假设是不正确的。其被后来的离子学说（钠学说）所代替。Eccles1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术（patchclamptechnique）；1980年Sigworth等获得10-100GΩ的高阻封接（Gigaseal），1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善；1983年10月，《Single-ChannelRecording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。NeherSakmann（1944-）（1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。二人共获1991年诺贝尔奖。内尔在实验室进行膜片箝研究工作1983年10月第一版《Single-ChannelRecording》封面电生理获医学诺贝尔奖名单（截止到2002年）获奖时间获奖者国别获奖工作获奖题目或著作1924埃因托芬(Einthoven)(1860-1927)荷兰研制成功记录心脏动作电位的心电图机并命名心电图波。“弦线式电流计和心脏动作电位的测量”1932艾德里安(Adrian)(1889-1977)谢灵顿(Sherrington)(1857-1952)英国英国发现神经元的功能“神经纤维的活动”《神经系统的整合作用》1944加塞(Gasser)(1888-1963)厄兰格(Erlanger)(1874-1965)美国美国两人合作发明了示波器，并研究神经纤维的功能《神经活动的电表现》1963埃克尔斯(Eccles)（1903-1997）霍奇金(Hodgkin)（1914-1998）赫克斯利(Huxley)（1917-）澳大利亚英国英国用1微米尖端的微电极研究中枢兴奋和抑制两人合作揭示了神经元通过电脉冲与其它神经元传递信息“突触后抑制的离子机制”“神经传导的离子基础”“神经兴奋和传导的定量分析”1967哈特兰(Hartline)(1902-1983)格兰尼特(Granit)(1900-1991)美瑞典视觉神经生理（视觉神经元间的抑制）视觉神经生理（视网膜电图）“受体与感知”1970卡茨(Katz)(1911-)英国提出神经递质释放的量子学说“神经末梢的化学传递”1981休伯尔(Hubel)(1926-)威塞尔(Wiesel)(1924-)美国瑞典两人合作对视觉皮层的结构和功能进行了重要研究“视觉皮层的研究”“视皮层的发育和环境的影响”1991内尔(Neher)(1944-)萨克曼(Sakmann)(1942-)德国德国发明膜片箝技术，首次证实细胞膜上存在离子通道《单通道记录》第一节常规心肌电生理研究技术在常规心肌电生理研究中，主要是采用玻璃微电极插入在体或离体心肌细胞内，记录心肌细胞的跨膜电活动，并研究各种因素对其电活动的影响。一、常用电生理仪器刺激系统（刺激器等）检测系统（电极、换能器）放大系统（前置、后置放大器）记录显示系统(示波器、记录仪、计算机）1.电子刺激器（Electronicstimulator）电刺激不易损伤组织，又能定量而准确地重复使用。方波（矩形波，squarewave）的幅度、波宽和频率都可分别进行调节，所以矩形波电子刺激器可作为理想的刺激源。SEN-7203方波刺激脉冲的参数要求：（1）幅度（强度，amplitude）矩形脉冲电压的最大瞬时值（2）波宽（刺激持续时间time）（3）频率（frequency）一个脉冲循环所需的时间为周期，周期的倒数（即1S内所含的周期数目）称为频率（4）延迟（Delay）从触发脉冲到刺激方波的出现，这一段时间称为延迟。（5）刺激方式（Patternofstimulation）单刺激、连续刺激、双脉冲刺激（6）同步输出（Synchronizedoutput）同步脉冲表示一次刺激的时间起点（7）刺激隔离器（Isolator）当对实验动物同时进行刺激和记录生物电时，刺激器输出和放大器输入具有公共接地线，使得一部分刺激电流流入放大器的输入端，使记录器记录到一个刺激电流产生的波形，即刺激伪迹。隔离器切断了刺激电流从公共地线返回的可能，减小伪迹并与电位分开。同时，消除50周交流电感应造成的干扰。2.微电极放大器（microelectrodeamplifier）组成：精密稳压电源、高输入阻抗探头、主放大器、电容补偿电路、校正电路、低通滤波电路等Axopatch200B（AXON，USA）要求：（1）足够高的放大能力（2）频率响应范围大0—100Hz（3）低噪声50uV（4）高的辨差比（共模抑制比）1000:1（5）高输入阻抗1000MΩ（6）低频与高频滤波低频滤波----用于变化速度快的生物电变化高频滤波----用于减少噪声，提高信噪比3示波器（oscillograph）要求：高灵敏度扫描速度快频率高类型：双线示波器多线示波器长余辉慢扫描示波器记忆示波器VC-114贮存和分析电生理实验结果的仪器（1）示波照相机（2）磁带记录仪（3）电子计算机A/D转换--把生物电（模拟）信号转换成数字信号D/A转换--把数字信号转换成模拟信号二细胞外记录（Extracellularrecording）细胞外记录是把电极安放在心肌表面或附近引导心肌组织或细胞的电活动。适应范围：（1）长时间的实验；（2）对清醒的、能自由活动的动物研究；（3）从不同组织部位作同时的多导记录；（4）研究非常小的细胞，数量多而难于孤立起来，接触和穿刺都易于损伤等；（5）研究器官的总的活动。电极：（1）玻璃微电极（2）金属电极（3）离子选择性电极（4）单极电极（5）多管电极三在体心脏电活动的细胞内记录（intracellularrecordinginsitu）1实验装置包括浮置式玻璃微电极、微电极推进器、微电极放大器、示波器、照相装置、记录仪、计算机等推进器微放器示波器监听器照相机记录仪计算机打印机微电极心脏2动物手术3电极制作要求4插入5应用范围生理、药理、心肌缺血等6优点：在近于生理状态下实验，可观察整体因素对心肌电活动的影响，可研究药物及其代谢产物的作用过程，更有利于阐明各种调节因素、致病因素或药物对心肌电生理特性的影响机制7缺点：记录不持久，影响因素多四离体心肌电活动的细胞内记录（intracellularrecordinginvitro）1实验装置2微电极、标准微电极、微推进器3浴槽与灌流装置生理盐溶液、混合气体、摄氏30—37度4刺激器5应用范围6优点稳定、长时间记录，可任意改变溶液成分7观察指标RP,APA,APD10,APD50,APD90,Vmax第二节：电压钳制技术(Voltageclamptechnique)利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐明跨膜电变化机制，必需应用电压钳制技术。这一技术首先是由Cole及其同事设计，在经Hodgkin等人加以改进，用于神经电生理研究，弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。一、细胞膜的生物物理特性(Biophysicalpropertiesofcellmembrane)细胞膜主要由脂质和蛋白质构成。以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质颗粒。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质(cableproperties)的反映。(轴浆电阻与膜电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用――神经的“电缆”性质)。细胞膜的电缆特性从定的等效电路及其时间常数和空间常数及例证实。(一)细胞膜的等效电路从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为电阻－电容器。它具备细胞浆电阻（纵向电阻，ri），膜电阻（横向电阻，rm），膜电容（Cm）和膜电位（Em）四方面的电学特性，根据这四方面特性即可构成其等效电路（EquivalentCircuit）。outsideinside膜电位等效电路的简化图Cm膜电容Rm膜电阻Em离子平衡电位Ro细胞外液的纵向电阻（Ω/cm）Ri轴浆的纵向电阻（Ω/cm）RoCmRmEm+-细胞膜的等效电路是一个并联的阻容路，膜活动时既有电压的改变，同时又有电流的改变。电位的改变可引起电容器的充、放电，也可用于电阻器上的电流流动。通过电容器的电流为Ic，通过电阻的电流为Ir。1纵向电阻（Ro、Ri）由胞浆的性质所决定，具有较高的电阻率，它与直径是反比关系（直径大、电阻小，直径小，电阻大）。由于它的存在，使生物电的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。它是单位长度的电阻，单位是Ω/cm，细胞外间质的容积很大，其单位长度电阻（Ro）较Ri小。2.横向电阻（redialresistance）即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜由双层硷脂构成，厚度很薄，但具有很高的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过膜的有限能力。膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的大小反映了膜结构电学方面的差异。3.膜电容（capacity）表示膜的绝缘及储存电荷的性质。任何一种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排在一起，称为电容器。细胞外液及细胞内液均为含电解质的溶液，可看作为两个导体；细胞膜是含脂质的膜，可视作为绝缘体。细胞外液-细胞膜-细胞内液三者组成了电容。4膜电位（membranepotential）当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流动时，就相当于在电容器上充电或放电而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的高低决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高低与膜两侧的电荷成正比。5膜电流（membranecurrent）任何电流都是电容电流（Ic）和电阻电流（Ii）两种形式通过细胞膜，前者导致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携带流经细胞膜的。Im=Ic+Ii(二)细胞膜的时间常数（timeconstant）时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改变的（缓慢）程度。也就是膜电位通过膜电阻和膜电容充电到63%或放电到37%所需的时间。τ=Rm×Cmτ=膜的时间常数(ms）;Rm=膜电阻（kΩ）Cm=膜电容（μF）(三)细胞膜的空间常数（spaceconstant）所谓空间常数，是度量电压的空间衰减，即标志电压依距离而衰减的程度的一个常数。第二节电压钳制技术Vo