固定化酶

固定化酶组员海丹201421141033潘萌201421141026胡颖201421141047目录CONTENTS1定义及特点2固定方法3评价指标4影响因素5酶性质变化6应用1定义及特点定义什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术●将酶从微生物细胞中提取出，将其用固定支持物（称为载体）固定，使其成为不溶于水或不易散失和可多次使用的生物催化剂，这种固定的酶称为固定化酶。固定化酶特点@不溶于水，易于与产物分离；@可反复使用；@可装塔连续化生产；@稳定性好。优点缺点@固定化过程中往往会引起酶的失活@首次投入成本高@大分子底物较困难2固定方法固定化酶的方法主要包括吸附法结合法包埋法交联法1.吸附法吸附法物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。选择载体的原则:-要有巨大的比表面积-要有活泼的表面-便于装柱进行连续反应物理吸附法:-静止法-电沉积法-反应器上直接吸附法-混合浴或振荡浴吸附法1.吸附法吸附法优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱，易解吸附。载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。2.结合法离子键结合法概念：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。•第一个离子结合法固定化酶：DEAE—Cellulose固定化过氧化氢酶•第一个工业化的固定化酶：DEAE-SephadexA-50固定化氨基酰化酶•常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶•使用注意：pH、离子强度、温度2.结合法共价键结合法（1）概念:共价键结合法(共价偶联法)：通过共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联以制备固定化酶的方法（2）可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体2.结合法共价键结合法•首先载体上引进活泼基团•然后活化该活泼基团•最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键共价键结合法制备固定化酶的“通式”3.交联法交联法•交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。•常用试剂:戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛。3.交联法交联法双功能试剂：常用的是戊二醛OOH—C—CH2—CH2—CH2—C—H戊二醛的两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。3.交联法交联法图酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联•酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶。4.包埋法包埋法定义：酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中使酶固定化的方法。分为：网格型和微囊型4.包埋法包埋法1．网格型将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶的方法。也称为凝胶包埋法。4.包埋法包埋法2．微囊型包埋法将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。各类固定化方法的特点比较:标题数字等都可以通过点击和重新输入进行更改，顶部“开始”面板中可以对字体、字号、颜色、行距等进行修改。建议正文8-14号字，1.3倍字间距。标题数字等都可以通过点击和重新输入进行更改，顶部“开始”面板中可以对字体、字号、颜色、行距等进行修改。建议正文8-14号字，1.3倍字间距。比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶3评价固定化酶指标固定化后酶的考察项目测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。（1）考察固定化酶稳定性。（2）考察固定化酶最适反应条件。（3）评价固定化酶的指标12固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）评价固定化酶的指标345或称偶联效率，活力保留百分数。相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。4影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素123酶本身的变化：主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化载体的影响（1）分配效应（2）空间障碍效应（3）扩散限制效应固定化方法的影响5固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化12固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降原因：酶结构的变化、空间位阻固定化对酶稳定性的影响（1）操作稳定性提高。（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。（3）对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。（4）对分解酶的稳定性提高。（5）对变性剂的耐受力升高。固定化后酶性质的变化固定化后酶稳定性提高的原因：•a.固定化后酶分子与载体多点连接。•b.酶活力的释放是缓慢的。•c.抑制自降解，提高了酶稳定性。固定化后酶性质的变化3PH对酶活性的影响：•（1）改变酶的空间构象•（2）影响酶的催化基团的解离•（3）影响酶的结合基团的解离•（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。固定化后酶性质的变化pH对固定化酶的影响•1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。•微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。固定化后酶性质的变化•2）载体带正电荷，pH向酸性方向移动。•3）产物性质对体系pH的影响•催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低。固定化后酶性质的变化45最适温度变化•一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。底物特异性变化•作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化•既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特异性往往会变化。固定化后酶性质的变化6米氏常数Km的变化Km值随载体性质变化•（1）载体与底物带相同电荷，Km’Km固定化酶降低了酶的亲和力。•（2）载体与底物电荷相反，静电作用，Km'Km6固定化酶的应用固定化后酶性质的变化1固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用•葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。•利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶•固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类•热点：固定化原生质体的应用固定化后酶性质的变化2固定化酶在医药治疗上的应用•固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素OH2NR2R1NH2NSOOOHNR1NH2NSOOOOHH1:D-(-)-PGA(R1=H,R2=NH2)2:D-(-)-PGM(RI=H,R2=OMe)3.D-(-)-HPGA(R1=OH,R2=NH2)4:D-(-)-HPGM(R1=H,R2=OMeH2OPenicillinGacylase+Ampicillin(RI=H)Amoxicillin(R1=OH)7-ACAasnucleus固定化后酶性质的变化2青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素固定化酶在医药治疗上的应用R2R1NH2NSNNSR3R1OOOOOOH2NNH2OHR3HOH+PenicillinGacylaseH2O7-ACCA(R3=Cl)7-ADCA(R3=Me)Cefaclor(R1=H,R3=Cl)Cephalexin(R1=H,R3=Me)Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)7-ACCAor7-ADCAasnucleus固定化后酶性质的变化3固定化酶在分析化学中应用•酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。固定化后酶性质的变化•特点：快速、方便、灵敏、精确•范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等•要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。酶电极固定化后酶性质的变化4固定化酶和亲和色谱•亲和技术的基础：是生物活性化合物生物特异信息的综合。•利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一性，可逆结合而设计的纯化方法。•是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方法。THANKYOU