固定化酶技术

固定化酶技术1原理2特点3制备方法4应用5发展趋势及建议水溶性酶1原理水不溶性载体固定化技术水不溶性酶（固定化酶）2特点稳定性高；酶可反复使用；产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开；固定化酶的反应条件易于控制生产可连续化和自动化，节约劳动力；设备小型化、可节约能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：缺点：固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化时，酶活力有损失长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应3制备方法必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸残基不发生变化）避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。基本原则：固定化应该有利于生产自动化、连续化。载体能抗一定的机械力。固定化酶应有最小的空间位阻。酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低，以利于工业使用。3.1固定化酶的传统制备方法3.1.1吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。3.1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。(1)网格型将酶包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。(2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。1.3结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。1.4交联法交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，使酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：(1)单独与酶作用；(2)酶吸附在载体表面上再经受交联；(3)多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体，再连接酶。交联剂的种类很多，最常用的是戊二醛，其他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。交联法的优点是酶与载体结合牢固，稳定性较高；缺点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活。3.2固定化酶的新型制备方法3.2.1共价固定法酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载体上另一基团共价交联来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向的目的。3.2.2氨基酸置换法利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。通过定点突变在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys残基上的巯基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。3.2.3抗体耦联法大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供偶联用的官能团可以通过赖氨酸的ε-氨基或末端氨基、天冬氨酸的β-氨基、谷氨酸的γ-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗体酶Fab片段保持了很好的催化活性。抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上的氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合实现抗体分子的定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高的同时免疫吸附活性也提高了3倍。3.2.4生物素--亲和素亲合法生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(0．0001％)的中性小分子辅酶。亲和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点(解离常数10~5mol／L)。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一性的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。Min等将生物素羧化载体蛋白、片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N末端，然后将这两个融合蛋白定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定性和固定效率均大大提高。4应用4.1在食品中的应用4.2在环境工程中的应用4.3医学和临床分析的应用4.1在食品中的应用4.1.1固定化木瓜蛋白酶应用于啤酒澄清长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而变得混浊。为防止出现混浊，目前主要是采取向啤酒中添加蛋白酶来水解啤酒中的蛋白质和多肽，但水解过度会影响啤酒保持泡沫的性能。Witt等1970年用戊二醛交联将木瓜蛋白酶固定化制成反应柱，生产所得啤酒在长期贮存中可保持稳定。Finely等人报道，用几丁质固定的木瓜蛋白酶可用于啤酒的大罐冷藏或过滤后装瓶进行处理，通过调节流速(酶柱法)和反应时间(分批法)，可以精确控制蛋白质的分解程度。处理后的啤酒和固定化酶易分开，固定化酶可以多次反复使用，极为经济。经处理后的啤酒在风味上与传统的啤酒无明显差异。4.1.2固定化酶用于水解牛奶中的乳糖牛奶中含有4.3～4.5％的乳糖，患乳糖缺乏症的人饮用牛奶后将导致不良后果，用乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反应器可以连续处理牛奶，将乳糖分解。此外，固定化乳糖酶还可以用来分解乳糖，制造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖浆。乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处理后，可以防止其在冰激淋类产品中结晶，改善口感，增加甜度。4.1.3固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种，它可以来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖浆。自1972年这技术产生以来，科学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提的葡萄糖异构化酶，并大量应用于工业生产中，今后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固定化酶。4.1.4固定化酶法脱去柑桔类果汁中的苦味柑桔类加工产品出现过度苦味是柑桔加工业中较重要的问题。造成苦味的物质主要是二类：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物(A环和B环)；另一类为果实中多种黄酮苷。脱去苦味的方法有：吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，而酶法脱苦主要是利用不同的酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。工厂生产中常采用固定化柚皮苷酶减少柑桔类果汁中的柚皮苷含量。Tsen等在1989年使用甲壳素固定柚皮苷酶，并且研究了固定化的动力学因子。Manjon等[14]使用空心玻璃床作为载体，分别在1977年使用DEAE-Sephadex，1978年使用单宁-2-氨基乙基纤维作为载体。1996年Puri等使用海藻糖，1998年Soures等使用醋酸纤维和三醋酸纤维制成膜固定酶。酶法去除苦味物质因为酶的生物活性特征而使其应用受到很多限制。为了在不改变底物理化性质条件下，使酶保持最大活性，通常要注意以下几个问题：固定化材料的选择；固定率；固定化后的酶活性；最适pH值；温度对酶活性的影响；酶在不同浓度果汁中受到的抑制作用；酶的保存。4.1.5固定化酶技术应用于食品检测固定化酶技术的发展使生物传感器应运而生。而它的问世不仅使食品成分的快速、低成本、高选择性分析测定成为可能，而且生物传感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制，降低食品生产成本，并给人们带来安全可靠及高质量的食品。生物传感器的核心元件就是其分子识别元件，即由生物活性物质经固定化后形成的敏感膜。Kurube用酶传感器测定了猪肉新鲜度；日本农林水产省研制出的滋味传感器，可品尝肉汤风味，用于肉汤生产过程的质量控制；Fernando采用电导型生物传感器来检查食品中有机农药的污染。4.2在环境工程中的应用4.2.1用于有机废水处理污水处理中常用的酶有辣根过氧化物酶、漆酶、酪氨酸酶等。这些酶可降解有机废水中毒性很强的酚类。利用固定化辣根过氧化物酶去除污水中的4-氯酚，去除率高达80%。用壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶处理含酚废水，并考察酚浓度对去除率的影响。研究表明，酚浓度低于100mg/L时，酚的去除率达90%以上，随着酚浓度的增加，酚的去除率逐渐下降。用固定化酶处理受污染水体中的农药也取得了很好的效果。用聚丙烯负载二氧化钛膜固定农药降解酶，降解农药甲基对硫磷。研究发现，甲基对硫磷在30min内降解了70%以上。尤其等以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，固定化真菌漆酶对农药氯苯嘧啶醇进行降解。研究认为，在酸性条件下，固定化漆酶对氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。“用于污染水源修复的固定化酶复合材料及其制备方法”发明专利也用到了固定化酶。这种复合材料造价低，广泛应用于废水处理工程，是一种经济实用、前景广阔的新型环保材料，具有综合交叉学科集成创新的特点，为环保领域水处理工程技术带来崭新的突破。联合固定化技术使酶的特性得到了更好的发挥，扩展了固定化酶的应用范围。将脱色酶与苯胺降解菌混合固定用来处理染料废水。结果表明，脱色率及苯胺降解率分别达到80%和90%以上。用苯酚甲醛树脂吸附结晶型枯草杆菌—淀粉酶处理造纸厂废水，废水在反应器中停留4.5h，可去除废水中78%的悬浮胶态淀粉。4.2.2用于环境污染物的监测由固定化酶制成的酶反应器可以直接或与其他检测器组成酶电极、酶传感器等分析检测系统来实现对环境污染物的监测。由于农药的面源污染、未经处理的污水直接灌溉等问题，食品中的有毒有害物质成为环境监测对象。固定化酶技术可以实现对食品中有害物质的有效检测。用固定化草酸氧化酶完成了对河豚鱼中河豚毒素的快速检测。用聚乙烯醇苯乙烯吡啶固定乙酰胆碱酯酶，与捣碎提取设备、酶标仪组合了一套检测设备，对200多个蔬菜样品进行了成功的检测。4.2.3其他应用CO2是一种重要的温室气体。目前全球每年排放的数十亿吨CO2需要得到妥善的处置。固定化酶技术在固定CO2方面也取得了成果。据报道，以工业固体废弃物为原料，利用固定化碳酸酐酶和超重力强化反应可得到CO2的有效固定固定化酶技术在清洁生产领域具有潜在的应用价值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于纸浆漂白，可以避免产生传统造纸工艺过程中用氯漂白产生的难以生物降解的各类氯代有机物。固定化酶技术还在污水生物处理工艺中得到了应用。用大孔树脂固定水解酶类到两相厌氧反应器中处理黄浆废水。对厌氧滤池中的以纳米改性陶粒为载体固定化木瓜蛋白酶开展研究，都取得了一系列相应的成果。4.3固定化酶在医药治疗上的应用溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度（1）转入体内发挥作用（口服和注入）口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。注入：是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方式。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是