固定化酶生产生物柴油的现状及前景展望

固定化酶生产生物柴油的现状及前景展望Biodieselproductionusingimmobilizedenzyme:currentstateandfutureperspective安徽师范大学龚仁敏作者简介龚仁敏，教授，博士后，博士生导师，安徽省生物化学及分子生物学学会理事，安徽省科学技术奖评委，安徽省食品安全咨询专家。主要从事生物化学、生物技术、分析化学、材料科学、环境科学及化学生态学等领域的教学、科研工作，重点是化学与生物学交叉学科的应用基础研究。已在《Bioresour.Technol.》,《Chemosphere》,《DyesPigments》,《J.Hazard.Mater.》等10余种国际SCI期刊发表第一作者论文近30篇。电话:[phone](H)，13515530453(M)e-mail:[e-mail]生物柴油即长链脂肪酸的低级醇酯，由甘油三酯或游离脂肪酸与低级脂肪醇经转酯或酯化反应获得。一概述CH2-OOCR1CH-OOCR2CH2-OOCR33R-OHCH2-OHCH-OHCH2-OHR-OOCR1R-OOCR2R-OOCR3++R-OHHOOCR'R-OOCR'H2O++R=CH3orC2H5生物柴油生物柴油油脂低级醇低级醇甘油脂肪酸催化剂催化剂催化剂欧盟无疑是全球生物柴油生产的领跑者，2007年欧盟的生物柴油生产量为570万吨，年增长率为16%；2008年达到了780万吨，年增长率为35%；2009年则超过了900万吨，年增长率为16.6%。2009年欧盟生物柴油产量居前四位的国家分别是德国、法国、西班牙和意大利。转酯反应的催化剂分为化学或生物两类。化学催化剂包括碱性催化剂(氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠等)和酸性催化剂(硫酸、磷酸、盐酸，磺酸等)，生物催化剂则是各种来源脂肪酶。与酸催化法相比，碱催化法的转酯反应速率快、生物柴油产量高，因而化学法生物柴油生产中广泛使用的是碱性催化剂。事实上2007年全世界生产的全部大约850万吨生物柴油都是碱催化法生产的。但是如果原料油脂中游离脂肪酸含量大于0.5%，如使用废弃煎炸食用油时，碱催化就会发生皂化反应，导致生物柴油产量减少，皂化反应产物也增加了分离生物柴油的难度，另外，生物柴油纯化过程中产生大量污染环境的碱性废水，附着在碱性催化剂上高粘度的副产物甘油也难以分离。酸催化可以使用高游离脂肪酸含量的油脂原料，但需要更高的反应温度且醇与脂的摩尔比也远高于碱催化法(30:1)，酸催化法的反应速率慢且产量低，生产设备腐蚀也严重，所以酸催化剂在工业上很少使用。不过当原料等级较低含有较多游离脂肪酸时，可以采用酸催化加碱催化两阶段的反应过程，第一阶段酸催化游离脂肪酸酯化成生物柴油，第二阶段碱再催化剩余油脂的转酯反应。酶催化的转酯反应与化学催化相比有反应条件温和、相对节能、环境友好、副产物甘油易回收及适合高含量游离脂肪酸脂肪作为底物等明显优势，酶催化法已经开始工业规模的应用。酶的固定化能延长酶的使用寿命、降低酶的应用成本、改善酶的操作性能，因而固定化酶在酶催化生物柴油生产中也受到青睐。条件碱催化法酶催化法反应温度60-70℃30-40℃原料中的游离脂肪酸皂化产物生物柴油原料中的水干扰反应不干扰反应生物柴油产量一般高甘油回收难易生物柴油纯化反复洗涤无须洗涤催化剂成本低高碱催化法与酶催化法生产生物柴油的比较生产生物柴油需要油脂和低级醇两种原料，油脂主要来源于动物和植物。动物脂肪如猪油、牛油、鸡油及鱼油已用于制备生物柴油的研究，但生物柴油生产所用的油脂主要来自植物，许多食用及非食用植物油如大豆油、菜籽油、葵花籽油、棕榈油、橄榄油、棉籽油、亚麻籽油、蓖麻油、麻风树油和桐油已用于生物柴油生产。为了减少对食用植物油的依赖，废弃烹调油、微生物油和微藻油也已用于生产生物柴油。由于国情不同，各国生产生物柴油使用的油脂原料也有差别。美国主要用转基因大豆油生产生物柴油，欧盟和加拿大生物柴油生产的主要原料是菜籽油，巴西主要用葵花籽油和棕榈油制造生物柴油，东南亚国家马来西亚和印度尼西亚生产生物柴油则主要用棕榈油为原料，中国用废弃烹调油或非食用植物油如麻风树油作为生物柴油的原料则更现实。二生物柴油生产的原料用于生物柴油生产的低级醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇和异丁醇。醇的分子量越大，其密度越大、沸点也越高，通常脂肪酶催化转酯反应的速率随醇的碳链长度增加。上述低级醇中甲醇和乙醇的产量最大，价格也最便宜，所以工业上生物柴油生产主要用甲醇和乙醇作为酯酰基的受体。但相较于其他脂肪醇，甲醇和乙醇对脂肪酶的毒性更强。由于价格便宜，大多数国家用甲醇生产生物柴油，但巴西乙醇的价格低于甲醇，所以巴西生产生物柴油时用乙醇为原料。由于甲醇生产以天然气为主要原料，而乙醇则通过微生物发酵生产，所以巴西以乙醇为原料生产的生物柴油是真正意义上的“绿色可再生”燃料。研究人员考察了不同来源的脂肪酶对各种油脂的转酯活性，包括粘稠色杆菌脂肪酶、伯克霍尔德菌脂肪酶、产气肠杆菌脂肪酶、米黑毛霉脂肪酶、绵毛嗜热丝孢菌脂肪酶、荧光假单胞菌脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、枯草芽孢杆菌脂肪酶。生物柴油生产中要求非水介质中脂肪酶的单、双、三酰甘油的转酯活性及游离脂肪酸的酯化活性高，产物反馈抑制低，反应时间短，耐温度、耐醇毒性能力强，重复使用的固定化酶活力损失小。目前生物柴油生产中主要使用以下两种来源的脂肪酶：假单胞菌属脂肪酶如Pseudomonascepacia,Pseudomonasfluorescens和PseudomonasaeruginosaLX1、假丝酵母属脂肪酶如Candidaantarctica,Candidacylindracea,Candidasp.99-125和Candidarugosa，此外根霉属脂肪酶如Rhizopusoryzae、毛霉属脂肪酶如Mucormiehei及嗜热真菌属脂肪酶如Thermomyceslanuginosus也可用作生产生物柴油的催化剂。三脂肪酶的来源四脂肪酶的固定化脂肪酶费用高是酶法生产生物柴油的一个主要障碍，脂肪酶的固定化使酶易于回收并可重复使用，因此可以降低酶法生产生物柴油的成本。固定化也可以提高脂肪酶的热稳定性、pH稳定性、贮存稳定性、操作稳定性及化学试剂耐受力。吸附法制备固定化酶的反应条件温和、酶活力损失小、载体可回收并重复使用、固定化酶的成本低，因而吸附法制备的固定化酶是生物柴油生产中普遍采用的酶固定化方法。吸附法制备固定化酶的缺点是酶与载体结合较弱，使用过程中酶容易自载体上脱落，因而包埋法制备的固定化酶也被用于生物柴油的生产，迄今为止包埋法固定化酶的生物柴油转化率较低，可能与长链脂肪酸难以通过载体扩散至酶的活性中心及酶易自支持载体腐蚀脱落有关。近来还出现了在生物柴油生产中用共价结合固定化酶为催化剂的趋势。五甲(乙)醇对脂肪酶的毒性酶法生产生物柴油的另一个主要障碍是甲醇对脂肪酶的毒性，早期研究中采用逐步加入甲醇的办法降低它对脂肪酶的毒性，如今逐步加入甲醇仍然是减少脂肪酶失活、提高生物柴油产量首选的简单办法，但该法并不能完全消除甲醇对脂肪酶的毒性。消除甲醇对脂肪酶的毒性的第二种方法是改变酯酰基受体，研究人员分别用乙酸甲酯及乙酸乙酯替代甲醇及乙醇，将生产生物柴油的转酯反应改变为酯交换反应，最近替代甲醇生产生物柴油的酯酰基受体还有碳酸二甲酯。虽然该法消除了甲醇对脂肪酶的毒性，但是乙酸甲(乙)酯与油脂的高摩尔比(＞10)导致的高成本限制了方法的实际应用。CH2-OOCR1CH-OOCR2CH2-OOCR33R-OOCCH3CH2-OOCCH3CH-OOCCH3CH2-OOCCH3R-OOCR1R-OOCR2R-OOCR3++R=CH3orC2H5催化剂三乙酰甘油生物柴油油脂乙酸甲(乙)酯消除甲醇对脂肪酶的毒性的第三种方法是使用适当的有机溶剂，迄今为止最合适的溶剂是中等极性的叔丁醇，因为它既能溶解油脂也能溶解甲醇，避免了甲醇对脂肪酶的毒性，另外其价格便宜且易蒸馏回收。全世界第一个工业规模的酶催化生物柴油项目就使用了叔丁醇作为溶剂。最近国内外研究人员还试图通过以下途径解决甲醇对脂肪酶的毒性：1.菌种选育获得耐甲醇的脂肪酶，2.适当化学方法处理脂肪酶以提高其耐甲醇能力。六甘油对脂肪酶的失活作用甘油是生产生物柴油过程中的副产物,生产过程中生产的甘油吸附于固定化酶表面，并通过多种途径对酶反应产生严重的副作用。甘油在酶表面的吸附会使酶微环境的水活度降低，偏离反应的最适水活度，另外甘油在酶表面形成的亲水层阻碍了疏水性底物的扩散，增大了传质阻力，导致酶反应速度迅速下降。甘油可用化学方法或膜技术去除，更有效方法是用叔丁醇作为溶剂溶解甘油，消除甘油对脂肪酶的失活作用，或用乙酸甲酯及乙酸乙酯替代甲醇及乙醇，这样就避免了反应过程中产生副产物甘油。七固定化酶生产生物柴油的前景展望由于生物柴油的原料成本超过全部生产费用的70%，非食用植物油、废弃烹调油、微生物油和微藻油今后可能成为生物柴油的主要原料。目前固定化酶生产生物柴油的成本仍约为碱催化法生产成本的两倍，所以利用诱变及基因工程技术获得低成本、高酶活及耐甲醇毒性的脂肪酶是未来固定化酶工业化生产生物柴油的关键，采用新的固定化技术及适当化学处理以提高固定化脂肪酶稳定性以延长酶的使用寿命也是未来研究的重点。目前脂肪酶费用高是酶法生产生物柴油的最主要障碍，利用固定化产脂肪酶细胞生物催化剂是有前景的解决方法之一。固定化细胞可免除酶的提取纯化，提高了酶的稳定性，适合连续催化反应，产物分离纯化容易，有利于提高生产率，降低生产成本，如今固定化微生物细胞的胞内脂肪酶催化生产生物柴油已经成为生物柴油研究领域的一个新的研究方向。由于受到全球石油资源日渐枯竭、原油价格过度上涨和化石燃料燃烧导致的环境污染等一系列问题困扰，作为绿色可再生燃料的生物柴油因其环境友好、安全环保、燃烧性能优良等特性受到人类的广泛关注，近年来全球生物柴油产量迅速增长。随着酶法生产生物柴油研究的推进及产业化进程的加快，固定化酶生产生物柴油的技术将以其高效、安全、节能、环保、低成本等优势得以推广应用。谢谢关注！