食品常见有害物质的测定

食品常见有害物质的测定1概述2食品中有机磷农药残留量的测定3食品中黄曲霉毒素的测定食品中常见有害物质的测定•有害物质成分：农药、黄曲霉毒素、苯并比、亚硝胺类化合物、苯酚、多氯联苯、动植物毒素、氰化物、重金属元素、非金属元素、添加剂、激素、抗生素、兽药食品中农药残留量的测定•农药：农业生产中使用的各类农药。常用的有有机氯农药和有机磷农药2大类。•农药残留：指未分解而留存于土壤作物及环境进而留存与食品的农药。•测定方法：2003年新制定的《食品卫生检验方法》增加了42种测定农药的方法。用得较多的是气相色谱法，其次是高效液相色谱法、分光光度法。一、有机氯农药残留量的测定（GB/T5009·19—2003）•方法：第一法气相色谱法第二法薄层色谱法•有机氯农药的提取步骤：有机溶剂（丙酮、石油醚）提取净化浓缩食品中有机磷农药残留量的测定•测定方法多，最有代表的：GB/T5009·20—2003：第一法：水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留的测定该法采用的是气相色谱法，可检测20种有机磷农药。第二法：粮、菜、油中有机磷农药残留量的测定。该法采用的也是气相色谱法，可检测9种有机磷农药。•两者区别：用不同的色谱分离柱。GB/T5009·199—2003（蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测）：速测卡片（纸片法）酶抑制率法（分光光度法）•本法为定性检验方法，因为速度快，广泛使用中。⑴原理胆碱酯酶底物（碘化硫代乙酰胆碱）+显色剂（二硫代二硝基苯甲酸）→有色物质PH8.0无农药，胆碱酯酶催化能力强，显色深。有农药，胆碱酯酶催化能力弱，显色浅。吸光度变化小，与对照溶液的吸光度差值大，抑制率大，农药含量高。⑵试剂⑶仪器⑷测定步骤样品处理对照溶液的吸光度变化值测定⊿A0=A3min－A开始样品液的吸光度变化值测定⊿At=A3min－A开始⑸结果计算与判断⊿A0－⊿At抑制率（%）=——————×100⊿A0若抑制率≥50%为阳性结果，抑制率越大，农药残留量越高。第二节食品中黄曲霉毒素的测定一、有关知识黄曲霉毒素：AFT分类：AFTB、AFTG特征：（1）性质特征污染粮油及其制品对光、热、酸稳定，对碱和氧化剂不稳定（2）结构特征：含二呋喃环、香豆素（3）测定方法：•薄层色谱法•牛清抗体反应显色法•微粒筛选法二、黄曲霉毒素B1（AFTB1）测定（GB/T5009·22—2003）第一法薄层色谱法第二法牛清蛋白抗体反应显色法薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1测定1、原理样品中AFTB1经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后，在波长365nm紫外光下产生荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准品AFTB1最低检出量产生的荧光强度比较来测定样品中AFTB1的含量。2、试剂三氯甲烷（AR）正己烷（AR沸程30-60）或石油醚（沸程60-90）甲醇（AR）苯（AR）乙腈（AR）无水乙醚（AR）丙酮（AR）(以上试剂应重蒸，并应经检验对薄层色谱测定无干扰）苯-乙腈(98:2)混合溶液甲醇-水（55:45）混合溶液三氟乙酸（AR）氯化钠（AR）无水硫酸钠（AR）硅胶G（薄层色谱用）5%次氯酸钠：称取100g漂白精，加入500mL水，搅匀。另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3.10H2O）溶于500mL温水中，倒入上述溶液中，搅匀，澄清过滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，用作消毒剂。黄曲霉毒素B1标准贮备液：用百万分之一的微量分析天平精密称取1-1.2mgAFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光置于4℃冰箱中保存。使用前用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10ug/mL。（在350nm测定AFTB1的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩尔消光系数为19800，可根据朗伯-比尔定律求出其浓度）。•黄曲霉毒素B1标准应用液I（1ug/mL）：吸取1.0mL10ug/mL的黄曲霉毒素B1标准贮备液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。•黄曲霉毒素B1标准应用液II（0.2ug/mL）：吸取1.0mL1ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。•黄曲霉毒素B1标准应用液III(0.04ug/mL)：吸取1.0mL0.2ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液II于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容。3、主要仪器•玻璃板：5×20cm•涂布器•色谱展开槽（25×6×4cm）•紫外光灯：100-125W，带有波长365nm滤光片•微量注射器：20uL,10uL各一支4、操作步骤⑴、样品预处理称取4g混匀的花生油样品于小烧杯中，用20mL石油醚或正己烷，将其转移到125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分数次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇-水溶液移入第二分液漏斗，再用5mL甲醇-水溶液重复提取一次，提取液并入第二分液漏斗中。在第二分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，振摇2分钟，静止分层后，放出三氯甲烷层，经盛有约10g先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，分液漏斗中再加5mL三氯甲烷提取一次，三氯甲烷层一并滤入蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并入蒸发皿中。在通风柜中，将蒸发皿于65℃水浴上挥干，然后放入冰盒上泠却2-3分钟，准确加入1mL苯-乙腈混合液，用带橡皮头滴管的管尖将残渣充分混合，若有结晶析出，将蒸发皿取下，继续溶解、混匀，晶体消失后用滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。⑵、样品测定1薄层板的制备称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分钟，至成糊状后立即倒入涂布器内，推铺成5×20cm、厚度为0.25mm的薄层板三块。于空气中干燥约15分钟后，在100℃下活化2小时，取出放入干燥器中保存。2点样将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板底端3cm的基线上用微量注射器滴加样液和标准液：•第一点：10uL0.04ug/mLAFTB1标液•第二点：20uL样液•第三点：20uL样液+10uL0.04ug/mLAFTB1标液•第四点：20uL样液+10uL0.2ug/mLAFTB1标液要求点距边缘和点间距约为1cm,样点直径约3cm,大小相同，点样时可用电吹风冷风边吹边点。3展开在展开槽内加10mL无水乙醚，将点好样的薄层板预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮+三氯甲烷（8+92）混合溶剂，展开10-12cm，取出挥干。4结果观察将展开好的薄板放在365nm的紫外灯光下观察：a.若第一点无荧光或都无荧光。说明薄板或展开剂未制备好，需重新制备。b.第一点有荧光，而其余三点无荧光。说明样液中有荧光猝灭剂，样液需重新制备。c.第一点有荧光，第二点无荧光，三、四点有荧光。说明样液不含AFTB1或含量小于最低检出量。d.四个点都有荧光。需做确证实验后再进行定量。5确证实验于另一薄板上左边依次点二个样：•第一点：10uL0.04ug/mLAFTB1标液•第二点：20uL样液在以上两点各加一小滴三氟乙酸（TFA），待反应5分钟后，用电吹风热风2分钟，使温度不高于40℃。再于薄层板的右边点以下二个点：•第三点：10uL0.04ug/LAFTB1标液•第四点：20uL样液同第3步展开后，于紫外光下观察样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物AFTB2a,未加TFA的第三、四点作空白对照。6稀释定量若第二点的荧光强度比第一点强，则根据其强度估计减少点样体积，于另一薄板上点四个点：•第一点：10uL0.04ug/mLAFTB1标液•第二点：10uL样液•第三点：15uL样液•第四点：20uL样液展开后取荧光强度与第一点相同的样点进行计算。5、计算V1×DX=0.0004×————V2×mX——样品中AFTB1的含量ug/kg(ppb)V1——稀释前样液的总体积mLV2——出现同等荧光强度的稀释后样液点样量uLD——样液的稀释倍数