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1植物染色体组型分析一、实验目的1.学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法。2.观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。3.观察分析植物细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征；学习染色体组型分析的方法。二、实验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。各种生物染色体的形态、结构和数目都是相对稳定的。每一细胞内特定的染色体组成叫染色体组型。染色体组型分析就是研究一个物种细胞核内染色体的数目及各种染色体的形态特征，如对染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体有无等观测，从而描述和阐明该生物的染色体组成，为细胞遗传学、分类学和进化遗传学等研究提供实验依据。染色体组型分析大都采用植物根尖等分生组织的有丝分裂中期细胞，染色体制片要求分裂相为染色体分散，互不重叠，能清楚显示着丝点位置。然后通过显微摄影，测量放大照片上的每个染色体的长度和其它形态特征，依次配对排列，编号，并对各对染色体的形态特征作出描述。三、实验材料1.材料：洋葱（Aillumcepa）的鳞茎，黑麦，蚕豆（Viciafaba）的种子，2.用具：载玻片，盖玻片，50ml烧杯，温度计，恒温水浴锅，试剂瓶，镊子，解剖针，吸水纸，剪刀，绘图，纸胶水等。3.药品：Carnoy固定液，70％酒精，酸酒精，0.002M8-羟基喹啉，饱和对二氯苯水溶液，秋水仙素，1mol/HCl，石碳酸品红染色液。四、方法与步骤（一）植物有丝分裂1、材料处理先将种子用0.1～0.2%升汞（HgCl2）消毒10分钟，清水洗净后，置于23-25℃下发根至0.5cm，再移入0.05-0.1%秋水仙素溶液，根尖朝下且浸在药液中，25℃下培养直至根尖膨大。将洋葱，或黑麦，或蚕豆发根，待根长到1.5-2.0cm左右时备用；在分裂高峰期前3h，用0.002M8-羟基喹啉，或对二氯苯饱和水溶液，或0.02％秋水仙素溶液中，预处理3—4h；或放入冰箱(0—4℃)中预处理24h。前处理的作用，主要是阻碍纺锤丝的形成，使染色体缩短，改变细胞质的粘度，在压片时，有利于染色体的分散。2、材料固定经过前处理的根尖，再放到Carnoy液中固定24h以内。固定材料可以转入70％酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。固定的目的在于将细胞迅速杀死，使细胞结构尽可能保持原来的状态。3、材料解离方法：从固定液中取出根尖，用蒸馏水漂洗，再放到：①1mol/LHCl中，在60℃水浴中恒温解离8—10min；②用95％的酒精∶浓盐酸＝1∶1的溶液处理8—10min；倒去解离液，再加入固定液5ml，软化5min，然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使材2料呈白色微透明。4、制压、镜检切取根尖分生组织放在清洁的载玻片，剥取分生组织，滴加1-2滴苯酚品红染液，染色8～12min后加上盖玻片，覆以吸水纸压片，45%醋酸粉色、镜检。（二）核型分析1、测量：依次测量放大照片各染色体长臂和短臂的长度（随体是否计入臂长须注明）。根据测量、记录染色体形态测量数据计算：绝对长度（μm）=放大的染色体长度÷放大倍数染色体组总长度=该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和相对长度（%）=每个染色体长度÷染色体组总长度×100臂比=长臂长度÷短臂长度着丝粒指数=短臂÷该染色体长度×1002、配对：根据测量数据，即染色体相对长度、臂率、着丝粒指数、次缢痕的有无及位置、随体的形状和大小等进行同源染色体的剪贴配对。3、排列：⑴染色体对从大到小依次排列；等长染色体对，短臂长的在前；具随体染色体、性染色体可单独排在最后。⑵异源的染色体要分别排列（如小麦的A、B、D染色体组）4、剪贴：把上述已经排列的同源染色体按先后顺序粘贴在绘图纸上。粘贴时，短臂向上、长臂向下，各染色体的着丝粒排在一条直线上。所得组型图。5、分类：臂比是反应着丝点在染色体上的位置。根据此可确定染色体所属的形态类型。染色体形态类型：臂比（长臂/短臂）形态类型。1～1.7M中着丝粒染色体；1.71～3.0SM近中着丝粒染色体；3.01～7.0ST近端着丝粒染色体；＞7.01T端着丝粒染色体；SAT随体染色体。6、填表：将上述结果整理成“染色体形态测量数据表”染色体序号绝对长度（um）相对长度%臂比（长/短）染色体类型117.523.91.26M215.521.11.21M314.2418.91.59M(SAT)413.518.42.375SM51317770M总长度：73.75um(单倍的染色体实际总长)平均相对长度：207、综合描述⑴计数体细胞染色体数目：统计细胞数≥30，85%具有恒定一致的数目；⑵以分裂中期、高质量的体细胞染色体图像作为形态描述，以5个以上的细胞染色体，测其平均值。⑶核不对称系数（Ask）＝长臂总长÷全组染色体总长×100%⑷染色体的长短：按Kuo等的方法，以染色体相对长度系数（I.R.L）组成划分染色体的长短，即I.R.L≥1.26为长染色体（L）；1.01≤I.R.L≤1.25为中长染色体（M2）；0.76≤I.R.L≤1.00为中短染色体（M1）；I.R.L﹤0.76为短染色体（S）。2n=24=8L+2M2+10M1+4S。相对长度系数（I.R.L）=每条染色体的相对长度÷染色体的平均相对长度⑸染色体组型分类：Stebbins(1971)核型分类表。3染色体长度比臂比值＞2的染色体的百分比0.000.01-0.500.51-0.991.00＜2：11A2A3A4A2：1-4：11B2B3B4B＞4：11C2C3C4C染色体长度比＝最长染色体长度÷最短染色体长度染色体组型类型1A为最对称型，4C为最不对称型。⑹染色体组型的公式：芍药2n=2x=10=8M(2Sat)+2SM=6M+2SAT+2SM⑺染色体组型模式图：根据各染色体的相对长度平均值绘制一坐标图。横轴上标明各染色体序号，每一染色体与其序号相对应，纵轴表示相对长度值(％)，零点绘在纵轴的中部，并与各染色体的着丝点相对应。此即为该细胞的染色体组型模式图。六、实验报告做出蚕豆的染色体组组图、染色体组型分析表、染色体组型模式图。染色体形态测量数据表染色体序号项目长臂长度q短臂长度p染色体全长q+p臂比q/p染色体类型1实测值（mm）M(SAT)绝对长度（um）相对长度（%）2实测值（mm）绝对长度（um）相对长度（%）3实测值（mm）绝对长度（um）相对长度（%）n总长度：73.75um(单倍的染色体实际总长)平均相对长度：20；测微尺：xmm→10um4姐妹染色单体色差方法一、实验原理在DNA复制过程中，核苷的类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridine简称BrdUrd）或5-碘尿嘧啶核苷（5-Iodo-2′-deoxyuridine简称IdUrd）可以代替核苷酸掺入新合成的DNA链，并占有胸腺嘧啶（Thymidine，T）的位置。哺乳类细胞在含有适当浓度的BrdUrd的培养液中经历二个分裂周期之后，其中期染色体的两个单体的DNA双链在化学组成上就有了差别：即一条染色单体的两股DNA的T位完全由BrdUrd代替，而另一条染色单体的两股DNA中的一股含BrdUrd，另一股则不含BrdUrd。这样的细胞经过制片和苯并咪唑荧光染料（Hoechst-33258）染色后，在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体显示强弱不同的荧光。两股DNA链都含有BrdUrd的单体荧光较强，其中只有一股有BrdUrd的单体荧光较弱。但由于荧光染料发出的荧光消失较快，只能立刻在荧光显微镜下照相而不能长期保存。1974年Korenberg和Freedlender改进了这一技术，单独用Giemsa染色即获得姐妹染色单体差别染色（sister-chromatiddifferentialstaining简称SCD）。来自一个染色体的两条单体之间同源片断的互换称为姐妹染色单体互换（sister-chromalidexchange，简称SCE）。这种互换是完全的，对称的。由于姐妹染色单体染色上的明显差异，如果姐妹染色单体间在某些部位发生互换，则在互换处可见有一界限明显、颜色深浅对称的互换片段，故SCE易于计数，即使在一定距离内发生多次互换，也可被检测出来。目前认为SCE反映了DNA的损伤，可以使用SCE作为哺乳类动物突变形成的指标。由于SCE分析方法比观察染色体畸变更简便、迅速、敏感，并表现出很好的剂量效应关系，因此，目前已将此法列为检测诱变剂或致癌物的常规指标之一。二、实验试剂1.RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA），秋水仙素，青、链霉素，姬姆萨染液等。2.小牛血清：最好经过透析处理。将小牛血清装入透析袋中，用线扎紧封口，小心检查，切勿有漏孔。然后将透析袋放在盛有双重蒸馏水的玻璃器皿中，每隔1—2小时换一次水，搁置在4℃冰箱中，24小时后赛氏滤器灭菌过滤。3.3.5%NaHCO3溶液：称3.5克NaHCO3，用100毫升双蒸水溶解，10磅15分钟高压灭菌，调节pH用。4.BrdUrd溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下用分析天平称取BrdUrd2毫克，然后在无菌室内加入灭菌生理盐水4毫升，母液的浓度为0.5毫克/毫升。用黑布避光，置冰箱中保存。最好现配现用。55.1mol/LNaH2PO4，pH8.0的溶液；称取120克NaH2PO4，加入1000毫升双蒸水，用NaOH粉末调pH至8.0即可。6.2×SSC溶液（0.3mol/L氯化钠，0.03mol/L枸橼酸钠，称取NaCl17.54克，枸橼酸钠8.82克，各用蒸馏水1000毫升溶解，使用时两溶液等量混合。7.pH为6.8的mol/L/15磷酸缓冲液：甲液：取KH2PO49.08克，溶于1000毫升蒸馏水中。乙液：取Na2HPO2·2H2O11.88克或Na2HPO4·12H2O23.87克，溶于1000毫升蒸馏水中，将50.8毫升的甲液与49.2毫升乙液混合，即得pH为6.8的mol/L/15磷酸缓冲液。三、实验设备1.2毫升和1毫升灭菌注射器2.吸管，移液管，离心管3.量筒，烧杯4.无菌青霉素瓶，试剂瓶，培养瓶5.酒精灯6.载玻片7.天平8.紫外灯（15W）9.离心机10.恒温培养箱11.显微镜四、实验材料人的外周血。五、实验步骤1.在无菌条件下，用20毫升的青霉素瓶分装5毫升培养液，其中RPMI1640占80%；6小牛血清占15-20%；PHA0.2毫升；青霉素100单位/毫升；链霉素100微克/毫升。最后用3.5%NaHCO3调节pH至7.2-7.4。2.每5毫升的培养液中加入BrdUrd0.1毫升，最终浓度为10微克/毫升。3.每瓶培养液中加入0.3毫升静脉血，轻轻摇匀，用黑布避光，立即置37℃温箱中培养。4.培养72小时左右，加入秋水仙素0.4-0.8微克/毫升，继续培养4小时。5.按常规收集细胞，用0.075mol/LKCl或蒸馏水低渗20分钟，用甲醇：冰醋酸3：1配制的固定液固定两次，每次15分钟，用气干法制片，一天以后将染色体制片放入70-80℃烤箱中烘烤1-2小时，或放在37℃温箱中存放备用。6.染色体标本的差别染色方法有两种：（1）碱的热溶液处理：将染色体标本浸在88℃的1mol/LNaH2PO4（pH为8.0）的溶液中，处理20分钟，取出后立即用蒸馏水冲洗，用常规Giemsa染色5分钟，再用蒸馏水冲洗，干燥，观察。（2）紫外灯照射诱发：染色体标本在37℃条件下搁置24小时后取出，放在45—48℃的水浴锅上，覆盖一层2×SSC溶液（0.3mol/LNaCl，0.03mol/L枸橼酸钠），15W紫外灯照射20-30分钟，灯管与载玻片之间距离为6厘米（照光期间防止2×SSC溶液干涸）。照射完毕，用蒸馏水冲去2×SSC，用3%Giemsa（pH6.8磷酸缓冲液稀释）染色5—10分钟，水洗，气干后镜检。7.在普通光学显微镜下观察，可见姊妹染色单体呈现鲜明的深浅不同的颜色。六、注意事项1.在本方法的基础上，如将培