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第9章离体授粉1离体授粉的概念和种类1.1离体授粉的概念离体授粉（pollinationinvitro）是指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方法授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，又称为离体受精（fertilizationinvitro）或试管受精（testtubefertilization）。1.2离体授粉的种类根据无菌花粉授于离体雌蕊的位置，可将离体授粉分为离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉三种方式。1.2.1离体柱头授粉离体柱头授粉是指通过雌蕊的离体培养，使无菌花粉授于柱头上，得到含有可育的种子和果实的技术（图7－1a）。离体柱头授粉是接近于自然授粉的试管受精技术。操作方法：取花药未开裂的母本花蕾表面消毒剥离雌蕊离体培养授以无菌粉图7－1离体授粉3种方式示意图1.2.2离体子房授粉子房内授粉（intraovarianpollination）：通过人工方法将花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发，并进行正常受精，最后获得具有生活力的种子。把花粉直接送人子房，实现受精作用是克服受精前障碍的有效途径。子房内授粉可分为两种类型，即活体子房内授粉和离体子房内授粉。1.2.2.1活体子房内授粉活体子房内授粉是指被授粉的子房并不离体，仍然在活体植株上，对其用花粉悬浮液进行授粉，使活体子房发育并形成成熟种子的过程。活体子房内授粉的操作步骤：①确定供试植物的开花和花药开裂时间；②对母本花蕾去雄并套袋；③采集父本花粉；④确定适于父本花粉萌发的溶液；⑤将花粉引入子房（直接引入法、注射法）。1.2.2.2离体子房内授粉离体子房内授粉是指用无菌花粉对离体培养的子房进行授粉，使其发育成为成熟种子的技术（图7-1b）。方法：取即将开花的花蕾，经过表面消毒，剥离花萼和花瓣，去掉柱头和花柱，在试管中将异种无菌花粉授于子房顶端的切口处，或将异种无菌花粉引入子房内（引入方法同活体子房内授粉），从而实现受精过程。图7－1离体授粉3种方式示意图1.2.3离体胚珠授粉离体胚珠授粉是指离体培养未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，最终在试管内结出正常种子的技术（图7-1c）。可以是单个胚珠（裸露胚珠），也可以是带有完整胎座或部分胎座的胚珠。图7－1离体授粉3种方式示意图1.3几种授粉方法比较活体子房内授粉适用于子房较大的植物，可克服柱头和花柱组织上出现的两性不亲和性。但对子房易脱落的植物不适用。离体柱头授粉解决了子房脱落和因胚乳发育不良使胚败育等问题。但不能克服因柱头和花柱组织造成的不亲和性的障碍。离体子房内授粉和离体胚珠授粉既可排除柱头和花柱组织对于受精的障碍，又可克服活体子房的脱落。2离体授粉的意义有性杂交是常规育种的一个主要手段，但有性杂交存在的问题：（1）受精前障碍（合子期前障碍）:①花粉在柱头上不能萌发；②花粉管不能进入胚珠；③花粉管在花柱中破裂。克服受精前障碍的方法有蕾期授粉、截断花柱、对花柱进行热处理、辐照处理、混合花粉授粉等。另外，通过离体授粉，把花粉粒直接送入子房，让花粉直接与胚珠接触，可消除柱头和花柱的障碍，从而实现受精并使种子得到发育和成熟。这就是离体授粉的意义。（2）受精后障碍：受精能正常进行，但由于胚和胚乳之间的不亲合性或胚乳发育不良，杂种胚不能发育成熟。这属于受精后障碍。因受精后障碍而导致远缘杂交的失败，可采用胚培养或子房培养或胚珠培养予以克服。3离体授粉的操作技术3.1试验材料的选择在进行离体授粉实验时，最好选用子房较大并有多个胚珠的植物，如茄科、罂粟科、石竹科的植物等。在单子叶植物中，最先获得成功的是玉米的离体子房授粉，后来离体胚珠授粉也获得成功（图7-2）。不论离体柱头授粉还是胚珠授粉，多保留母体花器官组织有利于离体授粉的成功。图7－2玉米子房示意图3.2离体授粉的程序①确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间；②去雄后将花蕾套袋隔离；③制备无菌子房或胚珠；④制备无菌花粉；⑤胚珠（或子房）的试管内授粉。离体授粉成功的标志：授粉后能由胚珠或子房形成有生活力的种子。4胚珠和子房培养4.1胚珠培养4.1.1胚珠培养的概念和意义胚珠培养的概念：胚珠培养是将胚珠从母株上分离出来，在人工控制的条件下，进行离体培养，使其生长发育形成幼苗的技术。根据培养目的的不同，可将胚珠培养分为受精胚珠培养和未受精胚珠培养。胚珠培养的意义：①通过未受精胚珠的培养作为试管受精的基础②通过受精胚珠的培养，防止杂种胚早期败育，获得杂种植株③通过未受精的胚珠培养，诱导出大孢子或卵细胞增殖，产生单倍体植株4.1.2胚珠培养的技术措施（1）材料的选择和灭菌受精胚珠：可根据培养的要求，由大田或温室取回授粉时间合适的子房。未受精胚珠：在授粉前适当时间摘取子房，进行表面消毒，无菌条件下剥离。用解剖刀沿纵轴切开子房，取出一个个胚珠，或者将带有胎座部分的胚珠一起取下接种。（2）培养基基本培养基：多为White、Nitsch、MS等，Nitsch使用更普遍。不同发育时期的胚珠对培养基的要求也不同。发育时期越早的胚珠对培养基的要求越复杂。如罂粟。离体胚珠发育中，培养基的渗透压起着重要的作用，特别是对幼嫩的胚珠。（3）胎座和子房对胚珠培养的影响胚珠是否带有胎座，对培养的胚珠发育有显著的影响。对带有胎座或子房的胚珠进行培养时，所需培养基较简单，而且受精后的胚珠也容易发育成种子。原因：胎座或子房的某些组织在胚珠发育初期起着重要的作用。（4）胚发育时期的影响胚珠授粉后的天数对培养的胚珠发育也有显著的影响。一般来说，合子和早期原胚期的胚珠较难剖取和培养，对培养基成分也要求严格。培养发育到球形胚期的胚珠，较容易获得种子，对培养基的要求也不高。4.2子房培养4.2.1子房培养的概念和意义子房培养的概念：子房培养是指将子房从母体上分离下来，置于培养基上，使其进一步发育成幼苗的技术。类型：根据培养的子房是否授粉，可将子房培养分为授粉子房培养和未授粉子房培养。子房培养的意义：①通过未授粉子房培养，使未受精胚囊中的单倍性细胞诱导发育成单倍体植株②通过授粉子房培养获得杂种植株③通过未授粉子房培养作为试管受精的基础4.2.2子房培养的操作技术（1）子房外植体的制备①子房外植体的选择：对未受精的子房，一般选用开花前1～5d大田种植植株的子房；对受精后的子房，根据培养目的，选择授粉后不同天数的子房。②表面消毒后（消毒技术？），将子房接种于合适的培养基上进行培养。（2）培养基基本培养基：用于子房培养的培养基有MS、White、B5、N6、Nitsch等。培养基的成分对子房的生长发育及成熟有很大的影响，如屈曲花（p143）。（3）培养子房的发育未受精子房：由于在子房中存在两种细胞，即性细胞和体细胞，它们都可产生胚状体或愈伤组织，进一步发育成植株。来源于性细胞的植株是单倍体植株；而来源于体细胞，即由珠被和子房壁表皮二倍体组织产生的植株，则属二倍体。受精子房：可直接发育成果实，或诱导合子形成胚状体或愈伤组织，从而获得杂种植株。（4）影响子房培养的因素由于子房培养的目的不同，要求子房的发育途径也不一样，可以通过控制培养基及激素条件调节子房发育的方向。此外，离体培养的研究表明，花被的功能不是仅仅充做性器官的保护结构，在果实和胚胎的发育中它也起着重要的作用（p143）。5离体授粉中影响结实的因子5.1外植体（p144～145）5.1.1柱头和花柱的影响柱头是某些植物受精前的障碍，要克服这种障碍，必须去掉柱头和花柱。如果不是受精前的障碍，则会使结实率降低。5.1.2胎座的影响在试管受精中，子房或胚珠上带有胎座，有利于离体受精的成功。同时多胚珠子房的离体受精也易成功。5.1.3外植体的生理状态由雌蕊上剥离胚珠的时间。开花后1～2d剥离的胚珠比开花当天剥离的胚珠结实率高。剥离胚珠或雌蕊时雌蕊的生理状态。剥离胚珠的时间选择在雌蕊授粉后和花粉管进入子房之前。授粉时的操作5.2培养基离体授粉涉及到两个主要过程：①花粉粒的萌发和花粉管的生长，结果导致受精；②受精的胚珠发育为成熟的种子，里面有一个有生活力的胚。第一个过程相对容易培养基最重要的作用在于促进受精胚珠的正常发育。5.2培养基培养基因素包括培养基的种类（Nitsch、White、MS等）Ca2+具有刺激花粉萌发和花粉管生长的作用蔗糖的浓度：一般4％～5％，玉米7%各种生长调节物质和有机附加物5.3培养条件光照：在离体授粉中，培养物一般都是在黑暗或光照较弱的条件下培养的。温度：离体授粉培养的温度一般为20～25℃5.4基因型离体子房培养与结实之间的效应取决于植物的种类。6离体授粉的应用（1）克服自交不亲合性（2）克服杂交不亲合性（应用潜力最大）（3）通过孤雌生殖产生单倍体（4）培育抗逆性植物7单个雌雄配子的体外受精20世纪90年代，植物生物技术领域中一项里程碑式的进展，是高等植物离体雌雄配子成功地实现了体外融合，融合产物（单个的合子）继而发育成胚，并最终产生了植株。其中包括4个步骤（p148～149）：（1）精子的分离（2）卵细胞的分离（3）精卵融合（4）融合产物的培养意义：p149复习思考题：1、什么是离体授粉？它有哪些类型？2、简述离体授粉的程序。3、什么是胚珠培养和子房培养？简述胚珠培养和子房培养的技术措施。4、离体授粉中影响结实的因子有哪些？5、离体授粉技术有哪些方面的应用？