筛查检测及其室间质量保证

新生儿干血斑G6PD筛查检测及其室间质量保证江剑辉广州市新生儿筛查中心一、干血斑荧光斑点测定法1．原理正常人：葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的催化下生成6-磷酸葡萄糖酸（6PG），并产生还原型辅酶Ⅱ（NADPH）,此产物在特定波长紫外线光照射下可发荧光。G6PD缺陷：因NADPH生成减少，则荧光减弱或不产生荧光。氧化型谷胱甘肽（GSSG）的应用：NADPH又参与红细胞氧化型谷胱甘肽（GSSG）转变为还原型谷胱甘肽（GSH）的反应，在反应液中加入GSSG，使NADPH被消耗并氧化成无荧光的氧化型辅酶Ⅱ(NADP)，使杂合子容易检出。GSHGSSGNADPNADPH（荧光）G6PD葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸6-磷酸葡萄糖酸（G6P）（6PG）↓磷酸戊糖红细胞G6PD代谢示意图NADP氧化型辅酶ⅡGSSG氧化型谷胱甘肽NADPH还原型辅酶ⅡGSH还原型谷胱甘肽2.仪器和材料1）仪器①ZF-1型（激发光波长254nm和365nm）紫外线分析仪(上海顾村电光仪器厂)。②水浴箱或电热烘箱。③新华定性滤纸。④3mm打孔器(钳)。2)标本：血纸片在室温下自然晾干，避免日照，尽快检测（或置4℃冰箱内1周内检测）。4）试剂3.实验操作步骤用打孔器取直径3mm的血斑纸片于试管或酶标板中加入反应混合液100ul孵化：置37℃温箱中或电热烘箱30分钟，用吸管取少量浸出液于滤纸上，立即用风筒（低挡凉风）吹干将滤纸置紫外灯下观察荧光反应。4.结果判断(1)正常：孵化10分钟后出现荧光。(2)轻度缺陷：孵化20分钟有荧光。(3)中度缺陷：孵化30分钟有荧光。(4)重度缺陷：孵化30分钟仍无荧光。荧光斑点试验的特异性高，对男性半合子和女性纯合子的检出率高达100％。对G6PD活性正常者与直接测定法（分光光度法）符合率为98.8％。方法学特点荧光斑点试验的特异性高，对男性半合子和女性纯合子的检出率高达100％。对G6PD活性正常者与直接测定法（分光光度法）符合率为98.8％。5.注意事项(1)孵化前检查试管内纸片是否在反应液内。(2)滴浸出液前摇动试管，以混匀浸出液。(3)每次滴后迅速吹干滤纸后才观察荧光，因斑点湿润时荧光会减弱。二、用荧光定量法测定干血斑G6PD活性1.原理：正常机体G6PD催化二磷酸己糖旁路反应的第一步为：G6P底物在G6PD催化下转变成6PG，同时伴随发生NADP减少，NADPH（可发荧光）增加。筛查血斑标本与底物试剂G6P和NADP在室温下混合30分钟可发生上述反应加入铜溶液使反应终止，用荧光仪在波长355nm激发光和波长460nm发射光下测定反应物荧光。通过标准曲线得出未知样本和质控品中G6PD浓度(U/gHb),G6PD低于切值者为G6PD缺乏。2.材料与方法(1)标本来源:新生儿筛查滤纸干血斑标本，采血滤纸为筛查专用S＆S903滤纸。(2)试剂及仪器:试剂盒荧光读数测定仪。(3)操作步骤打孔↓加G6PD酶反应混合液（100ul/孔）↓恒温25℃、振速1150r/min振荡30分钟,↓去纸片↓加200ul/孔铜试剂↓激发波355nm和发射波460nm荧光读数。3．结果判断(1)参考切值：G6PD=2.0IU/gHb(2)G6PD≥2.0IU/gHb判断为G6PD正常G6PD2.0IU/gHb判断为G6PD缺乏阳性(3)每个实验室应根据本筛查网络的标本条件和本地G6PD缺乏发病率设定切值.比色定量法（四唑氮蓝法）简介打纸片加200L缓冲液，在室温(18-37oC)下摇晃孵育20分钟。孵育20分钟加100ul的稀释液在550或570nm下读取读数（初始读数）。在室温(18-37oC)下孵育孔板10分钟，此步不要摇晃。在550或570nm下读取读数（终末读数）4.注意事项(1)G6PD反应混合液配制后要待充分反应15分钟才能使用(2)已配制的G6PD反应混合液保质期限为7天，应在保质期限内使用否则会对实验造成影响(3)荧光测定时间延长可能会影响测定荧光值，建议在加入终止液后15~30分钟内完成荧光检测（4）纸片降低测定的荧光值参加G6PD检测室间质量保证计划台北阳明大学提供质控品：10份/次，6~10次/年质控品送出后一周内完成结果上报质控结果