酶联免疫分析法

酶联免疫分析法基本要求了解免疫分析法的分类，酶标记免疫分析法中使用的酶熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的酶联方法和试验方法，熟悉ELISA反应条件的选择，掌握ELISA的定量计算，了解ELISA的灵敏度提高途径，熟悉ELISA放大系统。了解化学发光酶联免疫分析,标记酶和发光增强剂，常用的生物发光反应体系。酶联免疫分析法第一节酶联免疫分析概述第二节光度酶联免疫分析第三节发光酶联免疫分析第一节酶联免疫分析一、免疫分析1、免疫分析发展史免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待测物质（抗原或抗体）与其相对应物质（抗体或抗原）之间专一特异性反应而建立起来的一种高选择性分析方法。免疫分析主要基于用抗体（或抗原）作为选择性化学试剂以分析测定抗原（或抗体）及半抗原。2、抗原、抗体与免疫反应抗原是能够引起免疫反应的分子。免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。具有免疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。免疫反应原性（immunoreactivity）或抗原性（antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反应性的物质被称为半抗原（hapten）。Ag+AbAg-Ab该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，其反应式为式中：k1为正反应速率常数；k2为负反应速率常数；K为反应平衡常数（亲和常数）。Kkk21[Ab][Ag]Ag]-[Ab基于抗原-抗体反应的检测技术主要应用于以下几个方面：①用已知抗原检测未知抗体；②用已知抗体检测未知抗原；③定性或定量检测体内各种大分子物质；④用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质。二、酶标记免疫分析法及常用标记酶1、免疫分析法分类免疫分析标记免疫分析放射免疫分析法化学发光免疫分析法电化学免疫分析法荧光免疫分析法酶联免疫分析法竞争性酶联免疫分析非竞争性酶联免疫分析均相酶联免疫分析非均相酶联免疫分析非标记免疫分析沉淀反应、凝集反应、免疫电泳、免疫扩散2、几种常用酶（1）对酶的要求①纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强；②具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；③使用稳定性和保存稳定性好；④测定酶活性的方法简便、灵敏、快速；⑤待测体液中不存在与标记酶相同的酶；⑥待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生反应的干扰物质；⑦酶的来源、纯化和供应较方便，价格较低廉；⑧均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原-酶结合物结合后，酶活性表现出抑制或激活。（2）酶的评价指标通常用RZ和酶的比活力评价标记酶的质量。RZ表示酶的纯度，以酶蛋白中活性部分与非活性部分最大吸光度的比值。HRPRZ＝OD403nm/OD275nm酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶或每1ml酶液所具有的酶活性单位数。HRP：RZ﹥3活性250u/mg，免疫学用；RZ2活性180u/mg，临床化学用；RZ1活性100u/mg，血糖试纸和尿液分析试纸用酶来源EC编号辣根过氧化物酶辣根1.11.1.7酸性磷酸酶动植物3.1.3.2碱性磷酸酶牛肠3.1.3.1β-D-半乳糖苷酶大肠杆菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶曲霉菌1.1.3.4脲酶Jack豆3.5.1.5青霉素酶—3.5.2.6过氧化氢酶肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶牛红细胞4.2.1.1乙酰胆碱酶—3.1.1.7葡萄糖-6-磷酸脱氢酶肠系膜明串细菌1.1.1.49溶菌酶鸡卵白3.2.1.17苹果酸脱氢酶猪心线粒体1.1.1.49无机焦磷酸酶大肠杆菌3.6.1.1荧光素酶发光生物1.3.12.7丙酮酸激酶哺乳动物组织2.7.1.40酶联免疫分析常用酶①辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）提取自辣根中，相对分子质量为44kDa的糖蛋白。HRP的纯度以RZ值即A403nm/A275nm的值来衡量，高纯度HRP制剂的RZ≥3.0。通常以能在20℃、pH为6.0、20s的时间内催化底物邻苯三酚产生1mg红桔酚（purpurogallin）作为HRP酶的1个活性单位。用于标记的HRP比活性应大于250U/mg。②碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）几乎存在于动物和人体的所有组织中，尤其在肝脏、胎盘、白细胞、肾小管中含量高。AP是一种磷酸酯的水解酶，它能够催化磷酸单酯、磷酸核苷及6-磷酸糖类等的水解，在释放磷酸盐的同时产生有色的或荧光的产物。碱性磷酸酶的分子质量为80～100kDa，最适pH为8.0～10.0，随酶源和底物的不同而变化。AP活性的测定以对硝基磷酸苯酯（PNP）作为底物。用作标记的AP比活力应大于1000U/mg。③葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）即β-D-葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生。它催化O2和β-D-葡萄糖的反应形成H2O2和D-葡萄糖酸-δ-内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。反应最适pH范围为4.0～7.0，pH5.5时，反应速率最大。葡萄糖氧化酶对β-D-葡萄糖的β-异头碳有高度专一性。葡萄糖氧化酶的比活力至少为20U/mg。葡萄糖氧化酶在4℃下可稳定存在6～12个月。④β-D-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase，Gal）即乳糖酶（β-lactase），广泛存在于植物、动物器官、细菌、酵母和真菌中。当Gal催化水解β-D-半乳糖苷时，若得到的半乳糖残基转移到水分子受体，称为水解；若受体是糖或醇时，称为转半乳糖苷。Gal催化β-D-半乳糖苷水解反应的最适pH为7.5，转化效率很高，且比HRP易于标记，背景值低，稳定性好。Gal比活力应不少于30U/mg，5℃能保存1～2年。第二节酶联免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)一、ELISA分析1、原理①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面；②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体；③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体反应；④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例；⑤加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。*Ag是酶标记抗原，Ag是未标记抗原，Ab是特异性抗体，(F)表示游离型的*Ag，(B)表示结合型的*Ag-Ab。**()()gbgbggbAAAAFBAAA2、ELISA的固相载体良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。最常用的是聚苯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。ELISA载体的形式有小试管、小珠和微量反应板。3、固相载体的包被与封闭（1）包被（coating）指将抗原或抗体连接到固相载体上的过程。以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于pH9.6的碳酸盐缓冲液（或pH7.2的磷酸盐缓冲液，pH7～8的Tris-HCl缓冲液）中，加满反应孔，置4℃过夜，洗涤即可。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为0.1～20µg/ml。（2）封闭（blocking）指继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。所有的ELISA固相载体均需封闭。常用封闭剂有0.05%～0.5%BSA；10%小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用（5%）。4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1）稀释液常用中性PBS或Tris-HCl缓冲液，其中含有无关高浓度蛋白（如10％动物血清、1％BSA（牛血清白蛋白）、1％明胶等）和非离子型表面活性剂（如0.05％Tween20或TritonX-100等）。（2）洗涤液一般与稀释液相同，常用PBS或Tris-HCl缓冲液。四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表7-2。编号吐温20/%组成稀释液10.05PBS0.01mol/L，pH7.42PBS0.05mol/L，pH7.43PBS0.05mol/L，pH7.4，含EDTA10mmol/L4PBS0.05mol/L，pH6.9，含EDTA10mmol/L洗涤液10.1PBS0.01mol/L，pH7.22PBS0.01mol/L，pH8.03Tris-HCl缓冲液0.01mol/L，pH8.0，NaCl0.15mol/L常用的抗体稀释液和洗涤液（3）酶反应终止液辣根过氧化物酶（HRP）反应终止液为2mol/L～4mol/LH2SO4（HRP在酸性条件下丧失酶活性）。很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶，用3mol/LNaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。5、ELISA法常用酶的底物系统ELISA法对底物的要求：价廉易得、安全；显色性和稳定性好；底物本身最好为无色物质；终止酶催化反应后，底物不应再继续地自发性变性；其最终产物可溶、易于测定及光吸收值高。（1）辣根过氧化物酶的底物系统常见底物有邻苯二胺（OPD，产物橙黄色，测定波长492nm）、5-氨基水杨酸（5-AS，产物橙色，测定波长550nm）、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB，产物红色，测定波长450nm）、2,2′-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）等。ABTS的反应曲线不好。OPD溶液具有光敏性，相对来说不稳定，且具有诱变特性。TMB的背景值低，溶液稳定，没有诱变特性。（2）碱性磷酸酶的底物系统常用的底物为对硝基磷酸苯酯（PNP），水解的产物为黄色的对硝基苯酚，可在405nm处检测其吸光度的变化，该底物的转化效率高，线性关系好。用酚酞磷酸酯为底物，水解生成的酚酞在碱性条件下呈红色，可在530nm处光度法测定。此外还可以百里酚酞单磷酸酯等为底物。（3）β-D-半乳糖苷酶的底物系统常见底物有邻硝基苯-β-D-半乳糖苷（ONPG），其水解的产物邻硝基苯酚在405nm处具有最大吸光度值。其他的底物有对硝基苯-β-D-半乳糖苷（PNPG）、苯基-β-D-半乳糖苷、氯酚红-β-D-半乳糖苷（CPRG）、9-羟基-3-异吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷（RG）等。（4）青霉素酶（PNC）的底物系统常用底物有溴麝香草酚蓝（BTB）、青霉酮酸还原淀粉-碘复合物（SIC）、溴甲酚紫（BCP）溴麝香草酚蓝（2︰1）等。二、ELISA酶联方法和试验方法1、酶联方法酶联结方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂，它可以联结具有氨基的酶和蛋白质。戊二醛交联法有一步法、两步法两种。抗体-NH2+HCCHOONH2-酶+抗体CCNHHN酶抗体CCNHHN抗体酶CCNHHN酶++戊二醛一步法反应原理①一步法将戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。•该法操作简便、有效，重复性好。•缺点是交联反应是随机的，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。HCCHOONH2-酶+CCNOHH酶抗体CCNHHN酶NH2-抗体戊二醛二步法反应原理②两步法先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体；或先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。•两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，有助于本底的改善。（2）过碘酸盐氧化法本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶（HRP）的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。2、ELISA试验方法三个必要试剂：①固相抗原或抗体；②酶标记抗原或抗体；③酶反