免疫组化讲课-原理及方法

免疫组织化学技术的原理及方法北京友谊医院病理科黄受方免疫组织化学技术的原理及其方法一.基本知识二.基本原理三.方法四.结果的判断及异常着色原因分析和对策一、免疫组化技术的基本知识一、免疫组化技术的基本知识免疫组化的基本概念利用抗原-抗体特异性结合原理检测抗原或抗体一般是用抗体检测抗原抗原两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具有抗原性抗体与抗原能特异性结合—生物学结合是免疫球蛋白Ig免疫球蛋白的化学结构及其模式图免疫球蛋白根据重链结构命名IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε),IgM(μ)五种免疫球蛋白只有两种类型的轻连，即：Kappa(κ)和Lambda(λ)每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子决不可能既有κ链又有λ链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。免疫球蛋白的化学结构及其模式图Fc(Fragmentcrystalline)是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段与抗原特异性有关Fab(Fragmentantigenbingding)该端是抗体与抗原特异性结合的部位，每分子Ig能结合2个抗原分子FcFabAg多克隆抗体与单克隆抗体及其产生多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）所产生的抗体多克隆抗体单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体及其产生多克隆抗体的产生以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录上常以RaH（RabbitagainstHuman）表之。多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。多克隆抗体与单克隆抗体及其产生单克隆抗体的产生应用细胞融合的杂交瘤技术（Hybridization），以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人（抗原）的抗体常以MaH表示，现在亦有兔的单克隆抗体免疫小鼠Mouse抗原的制备：传统用蛋白提纯近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗原的制备现有兔的单抗多克隆抗体和多克隆抗体的选用单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感性高，为何使用完全决定于使用的目的性市售抗体的种类某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋白酶有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。如Desmin来源于鸡的肌肉近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性标记抗体在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶金属离子：胶体金颗粒标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低酶—抗酶抗体复合物通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如PAP复合物（PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex），PAP复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。亲和素—生物素复合物（Avidin-BiotinComplexABC）亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性AB复合物多用于ABC法的免疫组化中酶标亲和素（Labelledstreptavidin）在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感多聚物载体一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKOEPOS及DAKOEnvision试剂核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物一步法：EPOStissueantigendextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule二步法：EnVision葡萄球菌蛋白A（StaphylococcalproteinA,SPA）二、免疫过氧化物酶染色技术的基本原理免疫过氧化酶染色技术的基本原理识别系统特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术的理论依据所在特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完成显示系统也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗原的存在及其定位显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀E(酶)+S(底物)E·S(酶底物复合物)P(反应产物)+E(酶)循环使用显示系统辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程:HRP+H2O2HRP·H2O2有色分子终末产物+HRPDAB（电子供体）HRP：酶H2O2：底物HRP·H2O2：酶·底物复合物免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异：间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶PAP法：利用PAP复合物ABC法：利用AB复合物LSAB法:利用直接标记于亲和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性显示系统联结系统联结或桥联抗体（一般为第二抗体）按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统一体应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多克隆还是单克隆：若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物的抗兔血清；若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血清有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗三、免疫组化染色方法的类别免疫组化染色方法的类别直接法间接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）两步法（Envision）直接法将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。优点：特异性高、非特异染色轻。缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记间接法将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺点：特异性差PrimaryAntibodySecondaryAntibodySubstrate-chromogenesolutionPAP法（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）组成：一抗是针对靶抗原的特异性抗体二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP）PAP法（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）优点：PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色可用于福尔马林固定的石蜡切片PAPPrimaryAntibodySecondaryAntibodyPeroxidase-anti-PeroxidaseSubstrate-chromogenesolutionABC法（Avidin-BiotinComplex，亲和素-生物素法）组成：一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素）优点：亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。能用于常规石蜡切片。亲和素—生物素复合物（Avidin-BiotinComplexABC）亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性AB复合物多用于ABC法的免疫组化中ABC法（Avidin-BiotinComplex，亲和素-生物素法）一抗二抗ABCDABABCABC与PAP法的比较LSAB（SP）法（labelledstreptavidinbiotinmethod）标记的链霉亲和素-生物素法特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上优点：更快速：空间结构更小更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结酶标亲和素（Labelledstreptavidin）在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感SPPrimaryAntibodyBiotinylatedSecondaryAntibodyEnsyme-conjugatedStreptavidinSubstrate-chromogensolutionABC与LSAB(SP)法的比较一步法（EPOS）及两步法（Envision）特点以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）优点操作简便，省时提高了敏感性和特异性减少了背景着色避免内源性生物素的干扰多聚物载体一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKOEPOS及DAKOEnvision试剂核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物一步法：EPOStissueantigendextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule二步法：EnVision一步法（EPOS）及两步法（Envision）比较Substrate-chromogensolutionEPOS一步法PrimaryAntibodyPolymercomplexSubstrate-chromogensolutionEnVision二步法四、免疫组化染色结果的判断及异常着色的原因分析及其对策特异性着色具备特点特定的组织特定的定位特定的细胞特定的细胞内的部位分布上的不均一着色的不均一性着色强度的不均一颗粒性显色：DAB显色剂应为棕黄到棕褐色免疫组化染色结果的判断CK染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色Kappa胞浆着色TdT染色，胞核着色PR胞核着色ER胞核着色免疫组化染色结果的判断对照的设置空白对照阳性对照吸收试验对照替代对照自身对照异常着色（假阳性）原因及对策异常着色原因内源酶及内源性生物素抗体本身原因切片制作不当冲洗不充分DAB显色产生背景着色抗原的丢失抗原的遮蔽抗体试剂因素操作不当假阴性的原因内源酶及内源生物素非特异性着色原因及对策灭活