免疫细胞及细胞因子的检测

第十三章免疫细胞及细胞因子的检测免疫缺陷症自身免疫病肿瘤淋巴细胞或淋巴细胞亚群的数量和功能的变化机体细胞免疫水平第一节免疫细胞的分离与纯化外周血的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板，可根据它们的理化特性，如细胞大小、密度、表面电荷和粘附能力等存在差异，分离不同的细胞群体。但淋巴细胞理化特性与其它细胞差异甚微，不容易分纯，所以产生了专门的淋巴细胞分离纯化技术，旨在于获得高纯度、高收率和高活性的不同类型和不同亚群特点的淋巴细胞。一、白细胞分离：自然沉降法红细胞密度1.093白细胞密度1.092灰白层二、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（PBMC）：包括淋巴细胞和单核细胞。红细胞密度1.093粒细胞密度1.092单个核细胞密度1.075-1.090血小板密度1.030-1.035密度为1.075-1.092的等渗分离溶液离心可分离各种血细胞和单个核细胞分离溶液的基本要求：①对细胞无毒；②基本等渗；③不溶于血浆等分离物质；④有一定的比重。较理想的细胞分层液：聚蔗糖—泛影葡胺，商品名为：FicollFicoll分离液法：单次差速密度梯度离心的分离法。方法：1、细胞分层液置试管底层；2、将肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面；3、水平式离心；4、离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（见图）本法分离的单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%~95%，细胞收率可达80%以上，但室温超过25℃时可影响细胞收率。用Percoll原液（密度1.135）与约等量的磷酸缓冲液均匀混合，经高速离心后，可使分离液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速离心后，便得四个细胞层。（见图）三、淋巴细胞的纯化与亚群的分离（一）淋巴细胞的纯化1、贴壁粘附法：利用单核细胞贴壁生长的特点；B细胞会有所损失。2、吸附柱过滤法：同样利用单核细胞具有贴壁生长的特点，粘附能力为：巨噬细胞或单核细胞树突细胞B细胞T细胞=红细胞。3、磁铁吸引法：利用单核细胞县有吞噬的特性，加入直径为3μm的羰基铁颗粒。（二）、淋巴细胞亚群的分离1、E花环沉降法：基本原理是利用T细胞有羊红细胞受体（E受体），可以与羊红细胞结合形成较大的E花环的特性，可将T细胞和B细胞分离。2、尼龙毛柱分离法：利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，将T细胞和B细胞分离。3、亲和板结合分离法：利用亲和层析和抗体固相包被原理。第二节淋巴细胞数量的检测一、T淋巴细胞数量的检测（一）、免疫荧光法：直接法、间接法（二）、酶免疫组织化学法：以酶作为抗体标记物→细胞酶免疫组化生物素——链霉亲和素放大系统提高灵敏度（三）、花环技术1、E花环试验2、抗体致敏花环法用相应的抗CD3单克隆抗体吸附于醛化的红细胞（致敏）+受检细胞→抗原抗体反应→受检细胞周围粘附3个或3个以上红细胞为花环形成细胞，计算花环形成细胞与计数淋巴细胞之比。（见图）E花环试验结果示意图二、B淋巴细胞数量的检测（一）、CD抗原的检测（二）、SmIg的检测：鉴定B细胞可靠的指标。第三节淋巴细胞功能的检测淋巴细胞功能测定是在免疫缺陷病及多种疾病的发病机制、疗效判断、免疫治疗及预后的重要依据。可分为体内实验和体外实验。一、T淋巴细胞功能的检测1、淋巴细胞转化实验刺激物基本原理：T细胞敏感刺激物在体外刺激T细胞→T细胞增殖、转化→根据其增殖转化能力评定相应的细胞功能。非特异性特异性①形态法外周血或单个核细胞+刺激物————→涂片染色镜检参考值：60%~80%，小于50%视为降低。评价：方法简便易行，受主观因素影响大。37℃培养72小时%100未转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数淋巴细胞转化率②放射性核素法外周血或单个核细胞+刺激物加适量3H-TdR记录每分钟脉冲数（cpm）SI=PHA刺激管cpm均值/空白对照管cpm均值。评价：结果客观，但价格昂贵，有放射性核素污染。37℃培养56小时培养16小时③MTT比色法外周血或单个核细胞+刺激物————→加适量MTT混匀————→比色法测OD值。评价：方法敏感、简单、快速、无污染。37℃培养70小时培养4~6小时均值对照孔均值试验孔ODODSI二、B淋巴细胞功能的检测临床常检测各类抗体B细胞的功能．对于免疫缺陷患者或科研实验时：①反向溶血空斑试验：检测人类Ig分泌细胞.淋巴细胞+SPA-SRBC+抗人Ig抗体+补体溶血空斑。②酶联免疫斑点试验：检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。抗原包被固相载体→淋巴细胞→酶标二抗→底物显色。评定37℃3~5小时第四节吞噬细胞功能的检测吞噬细胞单核一巨噬细胞系统：①非特异性地吞噬；②特异性免疫过程起作用。中性粒细胞：以吞噬功能为主，发挥非特异性免疫防疫作用并参与机体的免疫应答炎症损伤等。吞噬活动：趋化、吞噬、胞内杀灭作用三个阶段。一、中性粒细胞功能的检测（一）、中性粒细胞趋化功能的测定琼脂糖凝胶平板法（二）、中性粒细胞吞噬功能测定待检细胞悬液+白色念珠菌悬液美蓝染色→涂片镜检吞噬率61%-64%，对大肠杆菌杀菌率90%，对金葡菌杀菌率85%保温二、巨噬细胞功能检测基本原理：人巨噬细胞与鸡红细胞（CRBC）混合后孵育，通过计算巨噬细胞吞噬CRBC百分率和吞噬指数判断人巨噬细胞的吞噬功能。参考值：吞噬率61%~64%；吞噬指数接近于1。第五节、细胞因子的检测细胞因子：是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。测定方法：分子生物学测定方法，免疫测定方法、生物学测定方法。种类：白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、生长因子、趋化因子。表现为细胞因子网络。1、免疫学检测定法细胞因子的化学本质是蛋白或多肽，因而很容易制备得到相应的抗细胞因子的特异单克隆和（或）多克隆抗体，从而建立相应细胞因子的高特异性的免疫测定方法。主要方法：1、ELISA：用于可溶性细胞因子测定；2、流式细胞分析法3、酶联免疫斑点试验细胞内细胞因子的免疫测定2、生物学测定方法基本原理：根据待测细胞因子特定的生物学活性，应用相应的靶细胞指示系统，如各种依赖性细胞株，加入特定的细胞因子，观察靶细胞的相应反应，同时与特定的细胞因子标准品对比，从而由已知标准品推知标本中特定的细胞因子的活性水平，结果以活性单位（u/ml）表示。（1）、细胞增殖法（2）、靶细胞杀伤法（3）、细胞病变抑制法3、分子生物学测定法检测的并不是细胞因子本身，而是细胞因子的基因，一种细胞因子的表达分泌与否是与其基因的表达与否完全相关的。mRNA检测方法：①Northern印迹杂交法；②RT-PCR法；③原位杂交法；④原位RT-PCR法。DNA检测方法：①Southern印迹杂交法；②PCR法；③原位杂交法；④原位PCR法。