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临床免疫学检验1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能2、免疫防御（对外）；免疫自稳（防自身免疫病）；免疫监视（防肿瘤）。3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺；外周免疫器官：淋巴结、脾脏（最大）、黏膜相关淋巴组织4、B细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫；B细胞受体=BCR=mIg表面标志：膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体。成熟B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22（成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD）同时检测CD5分子，可分为B1细胞和B2细胞。B细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验（体液免疫功能）。5、T细胞：介导细胞免疫。共同表面标志是CD3（多链糖蛋白）；辅助T细胞的标志是CD4；杀伤T细胞的标志是CD8；T细胞受体=TCR。T细胞和NK细胞的共同表面标志是CD2（绵羊红细胞受体）；CD3＋CD4＋CD8－=辅助性T细胞（Th）CD3＋CD4－CD8＋=细胞毒性T细胞（Tc或CTL）（T细胞介导的细胞毒试验）CD4＋CD25＋=调节性T细胞（Tr或Treg）T细胞功能检测：植物血凝素（PHA）刀豆素（CONA）刺激T细胞增殖。增殖试验有：形态法、核素法。T细胞亚群的分离：亲和板结合分离法，磁性微球分离法，荧光激活细胞分离仪分离法*E花环试验是通过检测SRBC受体而对T细胞进行计数的一种试验；6、NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。直接杀伤靶细胞（肿瘤细胞和病毒感染的细胞）表面标志：CD16（ADCC）、CD56。测定人NK细胞活性的靶细胞多用K562细胞株，而测定小鼠NK细胞活性则常采用YAC-1细胞株。7、吞噬细胞包括：单核-吞噬细胞系统（MPS，表面标志CD14，包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞）和中性粒细胞。（表达MHCⅡ类分子）8、人成熟树突状细胞（DC）（专职抗原呈递功能）：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。9、免疫球蛋白可分为分泌型（sIg，主要存在于体液中，具有抗体功能）及膜型（mIg，作为抗原受体表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白）10、免疫球蛋白按含量多少排序：IgG＞IgA＞IgM＞IgD＞IgE五类（按重链恒定区抗原性（CH）排序）免疫球蛋白含量测定：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。11、免疫球蛋白的同种型抗原决定簇位于恒定区（CH、CL）12、抗体由浆细胞产生。抗体分子上VH和VL（高变区）是抗原结合部位。13、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白（IgG1最高），血液和细胞外液中的主要抗体。也是再次免疫应答的主要抗体，是唯一能通过胎盘的抗体，大多数抗菌抗体、抗病毒抗体是IgG，某些自身抗体及超敏Ⅱ型抗体是IgG，免疫学检测中第二抗体也以IgG为主。14、IgA：分血清型（单体存在）及分泌型；分泌型IgA（sIgA）为二聚体，性能稳定，主要存在于胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中，局部浓度高，是参与黏膜局部免疫的主要抗体。15、IgM：为五聚体，主要存在于血液中，是Ig中分子量最大的（又称巨球蛋白）。个体发育最早合成和分泌的抗体。抗原刺激后体液免疫应答中最先产生的抗体，感染过程中血清IgM水平升高，说明近期感染。新生儿脐血中若IgM增高，提示有宫内感染。16、IgE：为单体结构，正常人血清中含量最低。IgE为亲细胞抗体，介导Ⅰ型超敏反应。特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。17、补体：具有酶样活性的球蛋白（肝细胞、巨噬细胞产生）；激活途径主要有三种：经典途径（以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂（双链DNA），C1～C9全部参与）、替代途径（病原微生物细胞壁成分（脂多糖）直接激活补体C3，然后完成C5～C9的激活过程）、MBL途径（由急性炎症期产生的甘露糖结合凝集素（MBL）与病原体结合后启动激活）。18、补体系统中C3含量最多，C2含量最少。19、灭活：加热56℃30分钟，补体丧失活性20、补体清除免疫复合物的方式：吞噬调理；免疫粘附；免疫复合物抑制。21、完全抗原=反应原性+免疫原性。半抗原=反应原性（无免疫原性）22、抗原抗体结合力（分子间引力）：静电吸引、范德华力、氢键、疏水作用力（最强）23、抗原抗体反应的四大特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性；受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等）的影响。24、抗体过量——前带；抗原过量——后带（钩状效应）25、抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。26、颗粒性抗原出现凝集反应。可溶性抗原出现沉淀反应。单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。27、木瓜酶水解IgG为2Fab+Fc；胃蛋白酶水解IgG为F(ab)2+nFc。28、最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂加卡介苗）和弗氏不完全佐剂两种。29、R（兔子）型抗血清是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较宽，适于作诊断试剂。H（马）型抗血清是用马等大动物免疫获得的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般用作免疫治疗。30、抗血清常见保存条件：2-8℃保存；冷冻保存（最常用）；真空干燥保存（5-10年）。31、杂交瘤细胞放入液氮（-196℃）前，需要逐步降温。复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37℃水浴。32、凝集反应分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合；②出现可见的颗粒凝聚。33、直接凝集反应：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质（0.85%氯化钠）参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。抗原=凝集原，抗体=凝集素。34、玻片凝集试验：主要用于抗原的定性分析，AB0血型的测定。试管凝集试验：肥达氏试验、外斐试验、输血交叉配血试验；35、正向间接血凝反应（PHA）：红细胞包被抗原，用以检测抗体。（凝集）反向间接血凝反应（RPHA）：红细胞包被抗体，用以检测抗原。（凝集）36、间接血凝抑制试验：可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。（不凝集）37、金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）--协同凝集反应(反向间接凝集)38、血凝试验（载体为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞）可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，一般为1:64，同时设不含标本的稀释液为对照孔。凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。39、胶乳凝集试验（间接凝集），所用载体为聚苯乙烯胶乳；明胶凝集试验（间接）将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒：HIV-1抗体和抗精子抗体检测40、抗球蛋白试验，又称Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。包括直接Coombs试验（检测红细胞上的不完全抗体）和间接Coombs试验（游离在血清中的不完全抗体）41、沉淀反应分两个阶段：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见。第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。絮状沉淀试验：抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。42、免疫比浊：最适pH为6.5～8.5，磷酸盐缓冲液。（R型抗体，增浊剂如聚乙二醇（PEG）、吐温-20）。适合于大批量标本的检测。当反应液中抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。当抗原过量时，形成的IC（免疫复合物）分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。43、单向扩散试验是在琼脂内混入抗体，测抗原。Mancini曲线适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。Fahey曲线适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理，用半对数值画线，浓度对数与扩散环直径呈线性关系。双向扩散试验是对抗原或抗体进行定性分析。沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大沉淀线如果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大。不出现沉淀线则表明无对应的抗体或抗原或者抗原过量。*分子量小者扩散快，反之则较慢。由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如果两者分子量大致相等，则形成直线。*两条沉淀线互相吻合相连，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同。两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同。*出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。*出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯。出现多条沉淀线说明不纯。44、对流免疫电泳（双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术）：抗体流向负极，抗原流向正极；最适比例出现沉淀线。火箭免疫电泳是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项定量检测技术，实质上是加速的单向扩散试验。（抗体混合于琼脂中，样品孔中的抗原置于负极端，电泳时抗体不移动，抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰。）顶部呈不清晰的云雾状或圆形，则表示未达终点。免疫电泳技术：区带电泳+免疫双向扩散。用于纯化抗原和抗体成分的分析免疫固定电泳：电泳+沉淀反应技术，可用于各种蛋白质的鉴定（M蛋白的鉴定与分型，也用予尿液中本-周蛋白的检测及κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。）。45、RIA（放免）核素（125Ⅰ）标记抗原，竞争抑制（标记抗原和非标记抗原竞争限量抗体），反比关系；IRMA（免疫放射）核素标记抗体，非竞争结合（过量标记抗体，反应速率比RIA快，灵敏度明显高于RIA），正比关系。*RIA可以测定大分子和小分子抗原，但IRMA则只能测定至少有两个抗原决定簇的抗原。46、常用的荧光素有：异硫氰酸（FITC，最大吸收光波长490～495nm）黄绿色，最常用；四乙基罗丹明（RB200，最大吸收光波长为570nm）橘红色；四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC，最大吸引光波长为550nm）橙红色；藻红蛋白（R-RE）橙色。其他：铕（Eu3＋）47、荧光标记蛋白的常用方法：搅拌法和透析法。荧光抗体效价鉴定：抗原含量为1g／L时，抗体效价＞1：1648、时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）以镧系元素（如：铕）化合物为荧光标记物。49、偏振免疫测定的偏振波长是485nm（蓝光）。不适宜测定大分子物质。50、荧光酶免疫：由于使用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，故灵敏度大大提高。51、均相法：不分离，直接测（用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定）；酶放大免疫测定技术（EMIT）最早用于临床。酶标半抗原。EIA：异相法：先分离，后测定。固相酶免疫测定（如ELISA）52、酶联免疫吸附试验（ELISA）：辣根过氧化物酶（HRP）：底物（1）邻苯二胺（OPD），（2）四甲基联苯胺（TMB）ELISA中应用最广泛的底物。（HRP标记抗体或抗原的最常用方法——改良过碘酸钠法）碱性磷酸酶（ALP）：底物：对-硝基苯磷酸脂（p-NPP）β-半乳糖苷酶（β-Gal）：底物：4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU）必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶反应的底物。抗原测定：蛋白大分子抗原用得最多的是双抗体夹心法（HBsAg）。只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。抗体测定：通常使用间接法(HCV、HIV)、双抗原夹心法（HBsAb）、竞争法（HBcAb、HBeAb）和捕获法（IgM）等*待测孔最后显示的颜色深浅与标本中的待测抗原或抗体呈正相关的是：双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体；*封闭：1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清。53、化学发光底物有：直接化学发光剂：吖啶酯和三联吡啶钌；酶促反应发光剂：（标记酶HRP）鲁米