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聚丙酰胺凝胶电泳法分离丙球蛋白樊贝贝第二组Page2目录•简介•实训原理•材料与器材•操作步骤•注意事项Page3简介一、电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳)定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动，而达到分离目的的分析方法。作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。Page4聚丙烯酰氨凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。Page5聚丙烯酰胺凝胶的特性凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用；样品用量少，灵敏度可达10-6g;凝胶孔径可调节；分辨率高。Page6影响电泳速度的因素样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：电压电泳介质的pH和离子强度电渗作用Page7盘状电泳圆盘电泳是带电粒子(胶体颗粒、离子等)在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象.广泛应用于生物大分子的分离和鉴定。它是利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子的凝胶物。它同时兼有分子筛和电泳效应。当样品通过凝胶进行电泳时，便可以根据其样品中各分子的电荷和分子量的不同而泳动出不同的区带。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质较琼脂稳定，很少带有侧基，在电泳过程中，吸附作用与电渗作用均小，所以该技术的分辨率均高于其它琼脂电泳技术。Page8实训原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子的大小，形状的不同，在电场的作用下，产生不同的速度而分离的方法。它具有分子筛效应、电荷效应、浓缩效应三重作用。在这三重效应的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白质分离开来。Page9材料与仪器电泳仪、电泳槽、注射器、长针头、吸管、培养皿试剂：1.三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）2.贮备液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各贮备液，然后冷藏于4℃条件下，以防变质。Page103.染色液：0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。4.脱色液：7%醋酸溶液。5.电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml.6.示踪剂：0.01%溴酚蓝溶液Page11序号ABCDEF1mol/L盐酸48mL48mLTris36.6g5.98gTEMED0.23mL0.46mLAcr28g10gBis0.735g0.735g(NH4)2S2O30.14g蔗糖40g加水并稀释至100mL100mL100mL100mL100mL100mLPH8.96.7Page12操作步骤1.制胶：取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶帽。1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）：将试剂按A:C:H2O:F=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一烧杯中.用滴管将分离胶加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆盖，在烘箱中25~35℃下聚合，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7，浓缩胶）：将试剂按B:D:E:F=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。加入1厘米高左右，在小心地加入一层薄水。然后胶管于烘箱中25℃~35℃下放置，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。Page132.安装胶管把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。3.加样0.5ml新鲜血清，用5ml20%蔗糖溴酚蓝溶液稀释。用微量注射器或移液枪向胶管内加20ul样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液。Page144.电泳上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA。当示踪剂移至胶管下端1cm处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约2-3小时。5.剥胶取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。Page156.染色及洗脱1).将取下的胶条放入12.5%三氯醋酸中固定10min，用1%考马斯亮蓝水溶液染色15min，7%醋酸过夜保存。2).将取下的胶条放入7%三氯醋酸中固定10min，用氨基黑10B染色15min，7%醋酸浸泡过夜。注:染液回收。7.观察绘图将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。Page16注意事项1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。2．制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。3．注意观察实验现象：分界面，浓缩效应.4.染液回收。5．固体胶切忌倒入水池。Page17