仪器分析第十章色谱法导论课件

第十章色谱法概论AnIntroductiontoChromatography目的要求1.了解色谱法的分类及特点。2.熟悉色谱过程及常用术语。3.掌握色谱法的基本原理。第一节概述色谱法也叫层析法，它是一种高效能的和应用最广的物理或物理化学分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。一、色谱法的起源和发展俄国植物学家M.Tsweet于1906年首次提出色谱法：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。胡萝卜素叶黄素叶绿素利用不同物质在流动相与固定相相互作用时的行为差异得到分离(吸附)（2）石油醚流动相→相对运动固定相（吸附剂）CaCO3系统研究100多种吸附剂，数种淋洗液(1）粗叶绿素+石油醚柱色谱实验装置20世纪30年代离子交换色谱建立1931年库恩奥地利化学家胡萝卜素植物色素分离40年代Tiselius吸附色谱与电泳Martin分配色谱、纸色谱和薄层色谱技术50年代MartinSynge气-液色谱法提出塔板理论VanDeemter提出速率理论Golay发明高效毛细管柱气相色谱60年代Horvathe高效液相色谱法建立80年代离子色谱、超临界流体色谱、高效毛细管电泳、场流动分级分离Tiselius,A.W.K.Martin,A.J.P.Synge,R.L.M.1948年Nobel化学奖1952年Nobel化学奖吸附色谱与电泳分配色谱及塔板理论现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。二、色谱分离基本原理在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。色谱法的分离原理就是利用待分离的各种组分在两相中的分配系数、吸附能力、亲和能力等不同来进行分离的。使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上并与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。三、色谱法的分类色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。㈠按两相状态分类色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。分类情况如下：色谱法气相色谱法液相色谱法气-液色谱法气-固色谱法液-固色谱法液-液色谱法㈡按分离机理分类1.吸附色谱法:利用吸附剂（固定相一般是固体）表面对不同组分吸附能力的差别进行分离的方法。2.分配色谱法:利用不同组分在两相间的分配系数(或溶解度)的差别进行分离的方法。3.离子交换色谱:利用溶液中不同离子与离子交换剂间的交换能力的不同而进行分离的方法。4.尺寸排阻色谱法:利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法。㈢按操作形式分类1.柱色谱法固定相装在色谱柱内的色谱法。按色谱柱的特点可分为填充柱色谱和毛细管柱色谱。纸色谱法薄层色谱法薄膜色谱法2.平面色谱法(1)纸色谱法:利用滤纸作载体，吸附在纸上的水作固定相，样品点在滤纸一端，用流动相展开进行分离的色谱方法。(2)薄层色谱法:将固体吸附剂在玻璃板或塑料板上制成薄层作固定相，采用与纸色谱类似的操作进行分离的色谱方法。(3)薄膜色谱法:将分子固定相制成薄膜，采用与纸色谱类似的操作方法。色谱法气相色谱法液相色谱法填充柱色谱法毛细管色谱法柱色谱法平面色谱法超临界流体色谱法逆流分配色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法薄层色谱法纸色谱法回忆1.分光光度法对多组分定量分析的方法分类（解线性方程组3种、双波长分光光度法、导数光谱法）2.色谱的起源3.色谱的分离原理4.色谱法的分类①液相柱色谱的分类②气相色谱的分类③平面色谱的分类第二节色谱流出曲线（色谱图）及有关概念一、色谱法分离的过程分离过程（以分离A、B两组分为例）为：混合组分的分离过程及检测器对各组分在不同阶段的响应0246810120246810024681012024681002468101202468100246810120246810024681012024681002468101202468100246810120246810024681012024681002468101202468100246810120246810二、色谱流出曲线从流动相带着组分进入色谱柱起就用检测器检测流出柱后的流出物,并用记录器记录信号随时间变化的曲线，此曲线就叫色谱流出曲线，当待测组分流出色谱柱时，检测器就可检测到其组分的浓度，在流出曲线上表现为峰状，叫色谱峰。如图所示为一色谱流出曲线：三、基本概念1.基线:在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。2.峰高（h）和峰面积(A):色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。3.保留值死时间保留时间保留时间调整保留时间保留值死体积保留体积保留体积调整保留体积相对保留值(1)保留时间a.死时间(TM)：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。根据tM可求出流动相平均流速u。u＝柱长/死时间＝L/tMb.保留时间tR：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组分随流动相通过柱子的时间tM和组分在固定相中滞留的时间。c.调整保留时间tR′：某组分的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组分在固定相中的滞留时间。即tR′＝tR－tM保留时间为色谱定性依据。但同一组分的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。(2)保留体积a.死体积VM：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到：VM＝tM·FCFC—流动相流速b.保留体积VR：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。VR′＝VR－VM＝tR′·FCVR＝tR·FCc.调整保留体积VR′：某组分的保留体积扣除死体积后的体积。(3)相对保留值相对保留值r2,1：组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比。r2,1仅随温度及固定相变化。121212′′=′′=rrrr,VVttr注意：r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰i对标准峰的相对保留值，此时以表示：1,又称选择因子。)s(r)i(rtt′′=α4.色谱峰区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。区域宽度通常有三种表示方法：(1)标准偏差：峰高0.607倍处峰宽的一半。(2)半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.355(3)基线宽度W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W=4＝1.699W1/25.拖尾因子:又称对称因子，用于衡量色谱峰的对称性。计算公式:T＝W0.05h/2AT应在0.95～1.05之间。续前对称因子:T＝W0.05h/2A正常峰（对称）非正常峰前沿峰拖尾峰色谱峰——T在0.95~1.05之间——T小于0.95——T大于1.05色谱流出曲线的意义：（1）色谱峰数=样品中单组分的最少个数；（2）色谱保留值——定性依据；（3）色谱峰高或面积—定量依据；（4）色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；（5）色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。第三节色谱法基本理论色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离,组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远,两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但当两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。一、分配系数和保留因子与保留时间的关系(1)分配系数(K)：分配色谱的分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。它是描述分配过程的重要参数。分配系数是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即K只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。msCCK==溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度(2)保留因子(容量因子）（k)：在一定温度和压力下，组分在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为容量因子。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。也叫分配比或容量比。其中Vm为流动相体积，Vs为固定相体积mmssmsVCVCmmk===组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量称为相比率,它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱:=6～35；对毛细管柱:=60～600。(3)K与k的关系：kVVkVmVmCCKsmmmssms//(4)选择因子：色谱柱对A、B两组分的选择因子定义如下：A为先流出的组分，B为后流出的组分。ABAB)A(r)B(rKKkktt==′′=α二、保留因子与保留比(R′)的关系样品分子在流动相中停留的时间分数，以R′表示:溶质分子的总数数溶质在流动相中的分子＝′RR′＝1,溶质不能进入固定相，全部随流动相前移；R′＝0,溶质全部在固定相，不随流动相前移。R′在0~1之间，它可以衡量溶质被保留的情况。三、色谱分离的前提条件k＝ttaR10k＝ttbR10k＝ttbR10回忆1.基线2.保留值的分类3.色谱的分离原理（就是利用待分离的各种组分在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。）4.选择因子α、拖尾因子T、保留因子k、分离度R5.色谱流出曲线的意义6.分配系数、保留因子及它们之间的关系7.选择因子与调整保留时间、分配系数、保留因子之间的关系8.保留因子k与保留比R’、保留时间之间的关系一、塔板理论塔板理论是描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论。它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。1.塔板理论假定：（1）塔板之间不连续；（2）塔板之间无分子扩散；（3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；（4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；（5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。精馏塔(一）色谱分离过程：塔板理论是把色谱柱假想为一个精馏塔，塔内存在许多塔板，组分在每个塔板的气相和液相间进行分配，达成一次分配平衡。然后随着流动相按一个塔板、一个塔板的方式向前移动。经过多次分配平衡后，分配系数小的组分，先离开精馏塔（色谱柱），分配系数大的组分后离开精馏塔（色谱柱），从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。分离过程如下图所示(二)二项式分布先用液-液萃取过程来说明塔板理论。假设:取11个漏斗，编号从0,1,2…,固定相→VmL水流动相→VmL氯仿溶质→1.0gI2分配系数K=1n=0n=1N为0时碘的分配情况Sm1/2I21/2I2n=0n=1n=2N为1时碘的分配情况1/4I21/4I21/4I21/4I2SSSmmn=0n=1n=2n=3N为2时碘的分配情况1/4I21/4I21/8I21/8I21/8I21/8I2SSSSmmmn012345678910