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绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵2013141241098彭千2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。2、实验步骤2.1DH-5α和BL-21感受态细胞的制备（1）将0~4℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2mL的LB液体培养基中，37℃活化培养2～3h至OD=0.3～0.5。（3）取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。弃上清液，沉淀加入0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30min后，4℃下5000r/min离心10min。（4）弃上清液，沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20℃冰箱内保存。2.2感受态细胞的转化（1）取制备好的感受态细胞100μl，冰上解冻，均匀悬浮。（2）加入2μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30min。（3）42℃水浴中热击70sec后，冰上放置2min。（4）加入200μlLB液体培养基，37℃，50-100rpm振荡培养1h。（5）取200μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。二、质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测1、原理：首先选择好将绿色荧光蛋白导入大肠杆菌的载体，一般选用pET-28a质粒，因为该质粒具有多酶切割位点，并且导入外源基因后可以充分表达。已知pEGFP-N3质粒上携带表达绿色荧光蛋白的基因，此基因作为目的基因pET-28a质粒作为载体进行重组前需要先提取并检测。使用碱裂解法提取质粒，用到3种溶液，溶液I：50mM葡萄糖、25mMTris-Cl、10mMEDTA，pH8.0；溶液II：0.2NNaOH、1%SDS；溶液III：3M醋酸钾、2M醋酸。选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液来调节溶液ph。加入的葡萄糖可以使悬浮后的菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。溶液II中NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，会使细胞膜从双层膜向微囊结构的相变化，SDS为下一步做铺垫。溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于100kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。在pH为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛作用下，事分子大小和构象不同的核酸分子涌动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如溴化乙锭）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋＞线状＞开环。2、实验步骤2.1将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中（相应浓度抗生素），37℃培养过夜。2.2收集菌体将扩增的菌体收集1.5mlEP.管中。每次4℃，12000r/min离心2min，弃上清液后重复一次，弃上清液。2.3裂解菌体（1）将菌体沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡10min.（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内溶物，不可强烈振荡，放置冰上5min左右。（3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10s，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物分散均匀，置冰上15min。（4）4℃、10000r/min离心5min，将上清液转移到另一离心管中，并定量上清液的体积。2.4提取质粒DNA（1）加等体积酚：氯仿（1：1），于上清夜中，振荡混合，4℃、10000r/min，离心10min，将上清液转移到另一离心管中，冰定量上清液的体积。（2）加2倍体积的无水乙醇和0.1体积的3mol/LNaAc，室温下沉淀质粒DNA，振荡混合，放置30min。（3）4℃、12000r/min离心30min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。（4）用冰冷的1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次（每次用），不要搅起沉淀，弃上清、倒置于滤纸上，使沉淀干燥。（5）保存质粒取适量TE缓冲液溶解质粒DNA，混匀后-20℃保存备用。2.5DNA琼脂糖凝胶电泳的检测（1）装好制胶装置[用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好(一定封严，不能留缝隙),]使用水平仪，将胶板调至水平，插入适当梳子。（2）将1g琼脂糖加入30ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到60℃，加入1μl的Goldview，并摇匀），则为1％琼脂糖凝胶液。（3）将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。（4）充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中(注意：DNA样品孔应朝向负电极一端)，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1mm。（5）用移液器吸取质粒样品5μl于封口膜上，再加入1μl的6×加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（6）打开电源开关，调节电压至100V，可见蓝条带由负极向正极移动。（7）当蓝条带移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳（8）将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，DNA存在处显出荧光条带。三、PCR、酶切等方法获取目的基因，酶切连接重组质粒1、原理PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增。置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA新链。目的基因与载体扩增后要进行重组，利用共有的酶切位点即BamHl和NotI两个位点进行双酶切，产生相同的粘性末端便于在DNA连接酶的作用下重新连接。2、实验步骤2.1PCR实验（1）在0.2mlEP管内配置PCR反应体系一个。（2）混匀后瞬时离心。（3）放入PCR仪中，设置反应程序。2.2酶切实验（1）分别取两支0.2mlEP管做好标记。（2）两个EP管中分别配置两个体系即各加入一种质粒和两种限制性内切酶。（3）将两支EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h。（4）可取5μl进行电泳检测。2.3DNA的连接重组（1）在EP管中加入缓冲液，酶切后的载体质粒和荧光蛋白质粒以及DNA连接酶。（2）EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃反应20min，-20℃下保存用于转化。四、重组质粒导入DH5α扩增1、原理重组质粒虽已构建完毕，但是为得到大量的重组质粒，需要将重组质粒导入到DH5α中进行扩增。为了将重组质粒导入细菌中，我们首先得使得细菌处于易于吸收外源DNA得感受态。其原理是细菌处于0℃，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细胞便会膨胀成球形，易于吸收外源DNA。再加之转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。在将重组质粒导入细菌之后，就需要将细菌置于非选择性培养基上培养一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达。然后，再将培养的到的细胞转接到含有Kana的LB固体培养基上，便可以鉴定和筛选出重组子。2、实验步骤（1）取出感受态细胞DH5α让其在冰上自然解冻，每200μl解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。（2）42℃热冲击90秒，立即置于冰浴5min。（3）再在感受态细胞混合物中加入0.8ml的LB培养基，于37℃的摇床中培养1h。（4）1h后，6000r/min离心3min，去掉上清液（约留200μl的培养液），摇匀菌快。（5）用玻璃涂布器将溶液均匀地涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃倒置培养皿过夜。（6）第二天早晨，观察实验结果。五、菌落PCR鉴定阳性克隆1、原理菌落PCR可不必提取目的基因DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。在实验过程中，我们特意使用载体上的通用引物来筛选阳性克隆。2、实验步骤（1）在0.2ml的EP管内配制25μlPCR反应体系一个：18.5μlddH2O，2.5μl10*Buffer，1.5μlMgCl2，1μl4*dNTP，0.5μl的引物1，0.5μl的引物2，0.5μl的Taq酶，挑菌落一个。（2）用灭菌枪头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心。（3）放入PCR仪中，设置反应程序：①94℃预变性5min；②94℃变性30s；③55℃退火30s；④72℃延伸60s；⑤重复②~④30次；⑥72℃延伸10min。（4）取9μl反应液加1μl10*LoadingBuffer做电泳检测。六、pET-28a-EGFP的表达1、原理于重组质粒导入DH5α扩增步骤的原理相同，首先得到感受态细胞，然后将pET-28a-EGFP质粒导入其中，在培养基上培养，使其表达。2、实验步骤（1）取出感受态细胞BL21，让其在冰上自由解冻，5μlpET-28a-EGFP质粒加入200μl解冻的感受态细胞中，轻弹混匀后冰浴30min。（2）42℃热冲击90s，立即置于冰浴5min。（3）在感受态细胞混合物中加入0.8ml的LB液体培养基，于37℃摇床中培养1h。（4）1h后，6000r/min离心5min，去掉部分上清液（约留200μl的培养液），移液器吹打混匀菌液，再加入200μl的24mg/mlIPTG混匀。（5）移液器吸取混匀溶液于含Kana的LB固体培养基上，用玻璃涂布器均匀涂布，正置培养基半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜。（6）第二天观察结果，便可得到含有绿色荧光蛋白的大肠杆菌菌落。