第06章-常用分子生物学技术

第六章常用分子生物学技术主要内容：1.分子杂交技术Southern、Northern、Westernblotting；原位杂交、生物芯片2.目的基因制备技术PCR、cDNA文库、化学合成3.基因敲除技术4.RNA干扰技术第一节分子杂交技术分子杂交技术是利用生物分子之间的相互作用（单链核酸碱基互补配对，抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子），进行目的核酸、蛋白质检测，广泛应用于基因重组、生物印迹示踪、生物芯片等领域，具有高特异性、高灵敏性、高通量等特点的技术。方法；目的；应用；特点四方面。一、核酸的分子杂交核酸的酸碱性质和溶解度性质：核酸有磷酸基和碱基，为两性分子，但偏酸性。不溶于乙醇或异丙醇。核酸的紫外吸收：OD260核酸杂交的原理是核酸的变性和复性变性：在某些理化因素下（过量酸、碱，加热，变性剂如尿素等），DNA双链解成单链过程。本质是双链间的氢键断裂。变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。复性：在适当条件下，变性的DNA两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。核酸的杂交：序列互补的单链核酸根据碱基配对原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA核酸的分子杂交（重点）杂交分子：已经复性的DNA分子，如果两条链来源不同，则称为杂交分子。探针（probe）是指能够与靶分子核酸按照碱基互补原则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。探针可以是克隆的，也可以是合成的。探针需要标记物进行标记：同位素（32P、35S、3H），荧光基团，发光基团，生物素等。生物素生物素(biotin)是一种水溶性维生素，又名维生素H。MW244.31kD。能与一种碱性蛋白—抗生素蛋白高亲和结合。每个抗生物素蛋白可结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更牢固，可大大提高其灵敏度。生物素经活化后易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem，BAS）已在整个生物学领域中得到广泛应用•荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光显色：辣根过氧化物酶：底物为DAB；呈棕黄色碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT;AP最敏感的底物，呈紫色Blotting印迹技术§印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。§Southern印迹法：1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。§而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。1.Southern印迹●1975年，英，E.M.Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用探针杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。①提取DNA、酶降解②琼脂糖凝胶电泳、碱变性③变性DNA转移到NC膜、烘干、固定④预杂交固相膜，膜与DNA探针杂交⑤洗膜、放射自显影Southern印迹杂交纯化的待测DNA样品琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段凝胶上DNA变性中和DNA转印至NC膜预杂交限制性内切酶酶切后（EDTA，65℃灭活限制酶）变性液（碱变性）Tris缓冲液高盐下烘干、固定杂交放射自显影结果分析（2）Northern印迹●1977年，Alwine建立并经Thonas改进●待测核酸：RNA片段●探针：标记的单链DNA或RNA●用途：用于外源基因转录产物特异mRNA的检测Northern印迹Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。Northern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNA（3）Western印迹●待测物质：蛋白质●免疫印迹(immunoblotting)或蛋白质印迹(Westernblotting)是20世纪70年代末80年代初在蛋白质凝胶电泳与固相免疫测定结合基础上发展起来的蛋白质检测技术。是检测目标蛋白质的一项十分有效、常用的方法。蛋白质印迹流程：①蛋白质样品制备，作为抗原。②SDS-PAGE分离样品③转膜④固定在膜上蛋白质作为抗原，抗原抗体（一抗）结合⑤加入酶偶联或放射性同位素标记二抗，显色或放射自显影检测蛋白质。免疫印迹法示意图常用的抗体：1.放射性标记的抗体最早使用，定量最准确的方法。已逐渐被非放射性检测系统取代。2.与酶偶联的抗体酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)。显色：辣根过氧化物酶：底物为DAB；呈棕黄色碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT;AP最敏感的底物，呈紫色3与生物素偶联的抗体生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名维生素H。MW244.31kD能与抗生素蛋白高亲和结合。生物素经恬化后易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem，BAS）已在整个生物学领域中得到广泛应用蛋白质样品电泳非标记抗体（一抗）发生免疫反应荧光素酶或放射性同位素标记的第二抗体起反应通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分转膜（硝酸纤维素薄膜）方法：DAB：3’-3’-二氨基联苯胺（4）原位杂交定义：在组织或细胞水平，使用放射性的标记探针与细胞内DNA或RNA杂交的方法。覆盖滤膜取下沾有菌落的滤膜裂解、变性、固定等与探针杂交放射性自显影1234563和5是阳性克隆5).科学技术的重大变革：生物芯片技术美国《财富》杂志曾载文指出，在20世纪科技史上有两件事影响深远：一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一件事就是生物芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。什么是生物芯片(Biochips)？生物芯片是将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分析各种生物分子存在的量的一种技术。目前,生物芯片技术已经成为人们高效、准确、大规模地获取相关信息的重要手段之一,在生物、医学、农业、食品、环境科学等领域具有十分广阔的应用前景。有三类：微阵列芯片微流控芯片：芯片实验室根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片。目前,最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的基因芯片,也被称为“微阵列(DNAMicroarray)。”或DNA芯片。微阵列芯片1.基因芯片基因芯片是最重要的一种生物芯片，1998年底美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。由于基因芯片（Genechip）这一专有名词已经被业界的领头羊Affymetrix公司注册专利，因而其他厂家的同类产品通常称为DNA微阵列或DNA芯片基因芯片的工作原理：核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。按照载体上点的DNA种类的不同，基因芯片又可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片两种。基因芯片原理：6400点的基因芯片（面积12X14mm)6-25基因芯片技术流程图1、分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成cDNA；2、分别用Cy3（绿色）和Cy5（红色）两种荧光染料标记两种cDNA;3、将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交；4、激光扫描芯片杂交结果，计算机处理；5、分析杂交数据。确定基因多度或表达强度3）、应用(了解)：基因表达方式的检测基因测序基因诊断新药筛选临床用药2.蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。蛋白质芯片的基本原理蛋白质分子间的亲和反应。如：抗原-抗体、受体-配基间的特异结合。最常用的探针蛋白是抗体。蛋白质芯片基本流程蛋白质芯片基本流程高密度蛋白质分子（抗体）探针点阵固定在固相支持物上蛋白质芯片样品中蛋白质分子（抗原）用荧光或放射性核素标记蛋白质标记分子标记蛋白质与芯片上分子探针结合照相系统或激光扫描系统检测信号第二节目的基因制备技术1.PCR2.文库筛选：cDNA文库和基因组文库3.化学合成1.聚合酶链式反应(PCR)(PolymeraseChainReaction)是根据DNA半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起来的体外复制扩增DNA片段的技术，广泛应用于目的基因制备的几乎所有的分子生物学领域。该技术是现代分子生物学研究中一项富有革新性的创举，美国“Science”杂志评为1989年度十大科技新闻之一，Mullis博士也因发明这一方法荣获1993年度诺贝尔化学奖。1972年，穆里斯在美国加州大学伯克利分校取得有机合成专业博士学位。1979年进入西特斯生物技术公司任职，负责合成供实验用的短链DNA分子。(Perkin-ElmerCetusCorporation)。逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋行驶的汽车——一小段DNA引物……从1983年9月起，穆里斯陆续进行了一些实验，换过几个DNA模板，也尝试不同的加热、降温周期。在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。1984年11月，在三位技术员协助下，穆里斯的PCR实验取得可信的结果。1985年12月20日，第一篇关于PCR的论文，发表在《科学》周刊上。(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)在“人类分子生物学”专题研讨会上，穆里斯做了PCR原理及实验应用的报告。Mullis初期的实验是运用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenowfragment催化反应，这个做法不但烦琐，并且非常昂贵。1986年6月，西特斯公司的技术人员首次将耐高温DNA聚合酶应用于PCR过程，不仅大大简化了PCR操作程序，同时专一性及活性都比以前使用的酶更强。至此，PCR技术取得了完全的成功。聚合酶链式反应（PCR）原理三步曲：变性、退火、延伸以待扩增的DNA分子为模板，由一对分别与5‘端和3’端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为底物，合成新DNA，使目的DNA得到扩增。3’5’PCR基本原理：变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA5’3’5’3’变性5’3’退火：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在特定互补部位相配对，局部形成杂交链退火3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应再变