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主要内容：PCR技术的基本原理PCR反应体系与反应条件PCR扩增产物的分析PCR产物克隆PCR常用优化策略PCR反应特点针对RNA酶的一些注意事项PCR污染分析及对策PCR常见问题分析PCR应用的部分简介原位PCR荧光定量PCR多重PCR定量PCRSSCPPCR定点突变应用实例PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，在温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍。扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0(1+P)n。其中：C为扩增产物量,C0为起始DNA量,P为扩增效率,n为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量可增加一倍（理论上）。对于某些扩增片段很短的PCR反应，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。PCR原理图PCR反应体系与反应条件PCR反应体系试剂：1、反应缓冲体系：提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl(pH8.3~8.8，20℃)，在72℃(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于6.8~7.8之间。一般体系为：500mmol/LKCl、10mmol/LTris-HCl(pH8.4,20C)、150mmol/LMgCl。Tris-HCl用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KCl有利于引物与模板退火.高于50mmol/L的KCL,或50mmol/L的NaCl对TaqDNA聚合酶有抵制作用。2:在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度。TaqDNA聚合酶在合成新DNA链时,要求有游离的Mg2+,因而在PCR系统中确定Mg2+的最适浓度是必要的，故常需根据各自的实验预先试验,以确定本实验的最佳Mg2+浓度,保证DNA聚合酶具有良好的活性。通常Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2－2.5mmol/L。对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。3、Taq酶保护剂：一般用乙酰化的BSA（小牛血清白蛋白100μg/ml），起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，稳定酶活性及保护作用。或者改为5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)。另外加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利。保护剂还有明胶(0.01%)和Tween-20(0.05%~0.1%)。4、三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTrisHCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，一般存储浓度为10mmol/L，小量分装，-20℃冰冻保存。经过两次冷冻-加热循环，会使dNTP降解，储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存，储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上，因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。在PCR反应中，dNTP应为20～200μmol/L。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低，降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。dNTP会络合溶液中的Mg2+,而且大于200umol/L的dNTP会增加TaqDNA聚合酶的错配率.如果dNTP的浓度达到1mmol/L时,则会抑制TaqDNA聚合酶活性.理论上,100ul反应液中两种dNTP的浓度为20umol/L时,足以合成12.5ugDNA或合成10pmol400bp的DNA片段.5、Taq酶：Taq聚合酶相对分子质量为94000，其最适pH值为8.3～8.5，酶活性较高大约为200000Umg，Taq酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是72℃，转换数Kcat接近150nt，这种活性有明显的温度依赖性。目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，但保真度较差，在复制比较长的模板时容易发生点突变。通过遗传工程，已获得了高保真度的Taq聚合酶，大大提高了ＰＣＲ复制的精确程度。另一种为大肠菌合成的基因工程酶,能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。TaqDNA聚合酶虽然在90℃以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定，保持着催化DNA合成的能力。有人试验证明在92.5℃,95℃,和97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95℃（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80℃时，dNTP的掺入速度为35-100nt,最长延伸长度7.6kb，如对M13上的富含GC的30-me引物，该酶在70℃的延伸率高于60nt,在55℃仍有较高的延伸活性，22℃和37℃时延伸速度分别为0.25和1.5nt。由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90℃以上）时，很少能合成DNA。在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80℃，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。催化一典型的PCR反应约需酶用量一般为0.5～5个单位/100μl，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。6、模板：PCR反应的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，需先经过逆转录生成cDNA然后才能进行PCR反应。含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中。模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).由于环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA，故常用线性DNA分子。若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格，但是通常小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子。因此，建议在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量。就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板的纯度一般不要求很高，某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影响扩增反应的物质存在如：蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等；尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；二价金属离子的络合剂（如EDTA）等；会与Mg2+络合，影响TaqDNA聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。7、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会，但浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。引物GC约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔猝灭系数(EM)是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度(OD)值。EM可按下式计算：EM=A(16000)+G(12000)+C(7000)+T(9600)8、PCR促进剂：据报道通过向PCR反应体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。助溶剂包括甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和甘油(glycerol)；添加剂包括氯化四甲基铵(tetramethylammoniumchloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassiumglutamate)、硫酸铵(ammoniumsulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等。目前关于PCR反应促进剂对扩增效率的影响机制尚不清楚，可能是添加剂消除了引物和模板的二级结构，降低了DNA的解链温度使双链DNA变性完全。同时PCR反应促进剂还增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR反应起抑制作用，故在实验中应根据具体的情况选用适当浓度的PCR促进剂。几种常见的PCR促进剂:1)DMSO：反应体系中加入5－10%的DMSO（=DimethylSulphoxide二甲基亚砜）有利于DNA的变性