PCR

反转录PCR的原理与操作秦晓宁PCR原理：生物学的聚合酶链式反应，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术的分类1．逆转录PCR2．原位PCR3．甲基化PCR4．荧光定量PCR5．多重引物PCR6．随机引物PCR7．套式PCR反转录PCR概述是将RNA反转录和PCR结合而建立起来的一种PCR技术。其包括两个过程：通过逆转录合成cDNA和对之进行PCR扩增。其中，用于逆转录的RNA模板要求完整，并不含DNA和蛋白质等杂质。逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。反转录PCR原理反转录PCR首先要求我们从组织或是细胞中提取出RNA并以RNA为模板在反转录酶的催化下以dNTP为原料合成杂化双链，通过控制温度使其变形（解链）、复性（引物与模板结合）、延伸、反复循环等一系列的步骤扩增出我们需要的目的基因。原理示意图mRNA3’5’3’5’杂化双链cDNA变形解链3’5’3’5’cDNA3’5’AB上游引物下游引物复性（让引物与模板链结合）3’5’3’5’上游引物下游引物3’5’延伸PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增实验前器械的处理及准备工作1、用1‰DEPC水浸泡10ul、200ul、1ml枪头若干以及1.5ml、200ul的EP管过夜，浸泡过夜后高压灭菌，烘干备用。DEPC水倒入烧瓶中一起高压。2、由于我们的生活环境中存在大量的Rnase，可以降解RNA，所以在RNA提取的过程中要求尽量无菌环境。酒精擦拭操作台，含有RNA的溶液避免触碰没有处理过的材料和试剂，尽量少的走动、开门关门。在操作中避免碰到皮肤、衣物等。带好帽子口罩以及手套。3、由于试验中多出用到有毒物质，如DEPC、染色剂等，所以一定要树立防护和环保意识。结合本实验室如何操作实验前一小时制冰，制冰1-2小时即可制冰机Ⅰ总RNA的提取1、匀浆贴壁细胞的RNA提取：取一瓶培养好的细胞，倒掉细胞培养液，加入1ml-2ml生理盐水冲洗一次，将生理盐水吸干净，按照1ml/25cm2加入Trizol试剂，铺平后反复吹打，将细胞吹下，形成细胞悬液。2、分相将已经成悬液的细胞匀浆转移至1.5mlEP管中，在15-30℃环境中放置5分钟。按照每1mlTrizol加入200ul氯仿。盖好盖子震荡15秒，静置2分钟，继而4℃、10000rpm离心15分钟，然后可见EP管中液体分为三相，上层是无色水相，中间是灰白色中间相，下层为粉红色氯仿相，RNA即存在于无色水相中。无色水相（RNA）中间相（DNA）氯仿相（蛋白质）3、RNA沉淀将无色水相转移至新EP管中按照每1mlTrizol加入500ul预冷的异丙醇，轻轻震荡,冰上放置10分钟，然后4℃、10000rpm离心10分钟。离心后可见RNA呈针尖样的白点，沉淀于管底。立刻将RNA样本放入冰盒中。4、洗涤RNA弃掉上清液用75%乙醇（DEPC水配置）40ul洗涤RNA，洗涤两次将乙醇弃掉。（冰上操作）5、RNA溶解弃掉乙醇在空气中干燥10-20分钟，然后用DEPC水20-30ul溶解，（冰上操作）55-56℃孵育10分钟。**以上操作即为RNA的提取，由于RNA极易分解，最好即取即用。高速离心机Ⅱ琼脂糖凝胶的制备与RNA完整性的鉴定1、用1*TBE配置1.2%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.36g到入专用的烧杯中，5*TBE6ml，三蒸水24ml，混合后在微波炉中煮沸2分钟，冷却至60℃时加入染色剂。搅匀到入胶槽中，插好齿梳。15分钟胶凝固后，拔掉齿梳，将胶放入电泳槽中，孔道对准“-”极将电泳液到入电泳槽中。2、RNA完整性的鉴定：取RNA3ul与6*上样缓冲液3ul混匀，混匀后加入到任意孔道中。80-150V（我们一般用100-120V）电压下电泳。十分钟后紫外灯下观察18s和28s条带。黄色条带到整个胶块2/3时即可结束跑胶完整的RNA的可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。若两条带不明显,则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase,或操作剧烈。电泳槽、胶槽凝胶呈像系统ⅢRT-PCR步骤20ul体系1、取高压好的200ulEP管，按照以下顺序加入试剂DEPC水9ulOligo（dn）1ulRNA1ul5*M-MLVbuffer4uldNTP1ulRNase1ul100MDTT2ul反转录酶1ul2、加完后离心混匀，70℃变性5分钟，然后迅速在冰上冷却、然后再加入以下试剂试剂加入后一定要即使离心，然后在PCR仪中37摄氏度孵育一小时后95℃孵育五分钟，结束后迅速冰上冷却，合成的cDNA可在-20保存。PCR仪手掌离心机ⅣPCR部分取200ulEP管一枚加入反应体系（25ul），最适的反应体系是根据试剂盒配比出来的。这里用一种最为常用的反应体系举例说明。buffer2.5ulTaq（DNA聚合酶）0.2-0.5ul上、下游引物各1uldNTP1ulmg+-模板2ul去离子水补齐到25ul2）循环参数(1)变性使双链DNA解链为单链94oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。最适退火温度的计算：退火温度=（Tm上游+Tm下游）/2Tm值的计算：Tm=2*（A+T）+4*(C+G)（3）延伸70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定一般情况1kb以内的DNA片段延伸1分钟3-4kb的DNA片段延伸3-4分钟10kb以上的需要延伸15分钟（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加Ⅴ呈像制备琼脂糖凝胶，方法同前。取3-5ul样品混入3ul上样缓冲液后，加入到胶块的孔道中。80-180V电压跑胶。跑胶结束后在凝胶呈像系统中观察条带的情况。PCR常见问题假阴性，无扩增产物非特异性扩增拖尾•无扩增产物1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短原因对策1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多原因对策1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数•非特异性扩增•拖尾现象：产物在凝胶上呈彗星状态。M121.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多原因对策1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数•拖尾谢谢！