文献综述――实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********实时荧光定量PCR技术与应用***（**大学*****学院****级****班）摘要：荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定量技术，与常规的PCR相比，荧光定量PCR具有检测灵敏，精确，特异性强，无污染，快速等特点．目前该技术已广泛应用于不同研究的多个领域．本文综述了实时荧光定量PCR技术及其定量方法的研究与应用现状．关键词：实时荧光定量PCR，定量方法，应用Abstract：Real-timefluorescentquantitativePCR(RT-QPCR)isanewkindofnucleicacidquantitativetechniquebyusingdifferentfluorescence．IncomparisonwiththeconventionalPCRtechnique，real-timefluorescentquantitativePCRissensitive，accurate，specific，pollution-freeandspeedy．Atpresent，real-timefluorescentquantitativePCRhasbeenwidelyusedindifferentresearchfields．Inthispaper，thereal-timePCRtechnologyanditsquantitativemethods，researchstatusandfutureprospectsforitsapplicationareintroduced．Keywords：Real-timefluorescentquantitativePCR，quantitativemethods，application实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********实时荧光定量PCR(Real-timefluorescentquantitativePCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术．最早是由Higuchi等[1]于1992年提出来的，1996年由美国AppliedBiosystems公司推出．该技术在PCR反应体系中引入荧光标记基团，具有高灵敏性、高特异性和高精确性的特点.实时定量PCR实现了PCR从定性或半定量到准确定量的飞跃，目前，已经成为分子生物学和医学研究等领域的重要工具．[2][3]1.实时荧光定量PCR技术的原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[2]．其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确.并且消除了标本和产物的污染．且无复杂的产物后续处理过程．(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合目的检测物等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性．1.1工作原理[4][5]实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来，基本原理相同，主要不同之处在于其为定量体系.在PCR反应体系中加入有特定的波长的荧光染料或荧光基团，仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程．荧光扩增曲线包括三个阶段：背景信号阶段、指数扩增阶段和平台期.在荧光背景信号阶段和平台期，由于扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，或扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系．只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR扩增产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析．实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********图1.实时荧光定量PCR原理——扩增曲线[6]图2.实时荧光定量PCR原理——荧光阈值[6]实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********图3.实时荧光定量PCR原理——Ct值[6]图4.实时荧光定量PCR原理——Ct值的重现性[6]1.2定量原理在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标．并且引入一个Ct值（C代表cycle，t代表域值threshold）概念，Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数．一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值．为了便于对所检测样本进行比较，在realtime-PCR反应的指数期，首先需设定一个荧光信号的域值，一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍[7]．通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式．方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********析需要存在一个高相关系数(R20.99)，这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量．[8]研究表明，每个模板的Q值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小．因此要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线．再利用分析软件获得未知样品的Ct值，便能根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数．[9]实时荧光定量PCR——仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量．图5.实时荧光定量PCR原理——标准曲线[6]图6.实时荧光定量PCR原理——绝对定量[6]2.实时荧光定量PCR技术检测方法随着分子生物学技术的不断发展，迄今已建立了一系列的实时定量PCR技术检测方法．具体包括2大类，即探针类和染料类．[10]探针类是利用与靶序列实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;染料类如SYBRGreenⅠ则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加．目前，Real-timeQ-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是DNA结合染料法、水解探针法、分子信标法、杂交探针法、荧光引物法．[11][12]它们又可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测．扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子，如SYBRgreen1[13]等荧光染料．扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接法和间接法．间接的方法就是利用水解探针的策略．目前在real-timeQ-PCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理．直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标(molecularbeacon)就属于这一类．2.1SYBRGreenI荧光染料法是利用荧光染料与DNA双链的结合而被染色，此种方法也称为DNA结合染色(DNA-bindingdyes，dsDNA)．Real-TimeQ-PCR早期就是运用这种最简单的方法，特异的荧光染料能结合在DNA双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光，因此，扩增开始时检测不到荧光信号．随着扩增的进行，荧光染料与逐渐增多的dsDNA结合，荧光强度逐渐增强，直到达到阈值，被荧光探测系统检测到[13]．SYBRGreenI是一种能结合到dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的染料，在变性时，DNA双链分开，不产生荧光；在复性和延伸时，形成dsDNA，SYBRGreenI发出荧光．因此，荧光强度可以代表扩增产物的数量．[14]荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，降低了检测的成本而且检测方法简单易行．但是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号，这个问题目前可以通过有熔解曲线（meltingcurve）分析的软件加以解决．[15]图7.SYBRGREENI工作原理[16]实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********2.2TaqMan探针TaqMan荧光定量PCR技术是以TaqMan荧光探针为基础，利用DNA多聚酶的5’-3’外切酶活性来水解与目的序列杂交的探针．[17]该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5’荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET），因此探针完整时，检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光．在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合．在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5’-3’外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步．[18][19]图8.Taqman探针工作原理[16]2.3分子信标分子信标通常是一段长约25个核苷酸，在空间结构上呈发夹型，由环、茎秆组成的核苷酸序列．其链由两部分组成，一部分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列．是检测靶基因的部分，位于探针的中间位置．探针形成后构成探针的环部，另一部分是分别在5’和3’端的荧光标记物质和荧光淬灭剂．[20]环序实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********列部位与靶DNA序列互补，长约18～20个核苷酸，茎秆部分长约5～7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成．分子信标5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团．当分子信标处于自由状态时，发夹结构的两个末端靠近使荧光报告基团与淬灭荧光基团靠近，荧光信号被淬灭．当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结合，使分子信标的茎秆区被拉开，3’端与5’端分离，此时荧光报告基团不能被淬灭，荧光检测仪器可检测到荧光．[21][22]如果目标DNA序列同分子信标不能完全配对，那么杂交过程和信号就不会出现.这是由于分子信标的热力学特性倾向于形成发夹结构，而不是形成不能完全配对的杂交序列，这显著地增加了检测的特异性．图9.分子信标工作原理[16]2.4荧光标记引物荧光标记引物的作用原理就是荧光标记引物与扩增产物结合后发出荧光实现准确定量的技术[20][23]．它是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中．在没有单链模板的情况下，该引物自身配对形成发夹结构使荧光淬灭；在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号．荧光标记引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列，能更快地发射荧光，而且信号更为强烈．由于没有探针控制特异性；此，特异性要弱于探针技术．目前，荧光标记引实时荧光定量PCR技术与应用——***，*********物主要有3种:发卡式引物、蝎子引物和LUX引物．[24]图10.LUX引物工作原理[16]2.5双杂交探针双杂交探针又称为FRET探针或者LightCycle探针，采用两条相邻(距离1~5bp)、与模版互补的特异探针和一对序列特异性引物．第一个探针3’端带有荧光供体，第二个探针的5’端带有荧光受体．[25]在3’端用荧光激发供体基团，在毗邻探针5’端受体基团处实施荧光信号监测．在PCR反应变性后退火，探针头尾相连地杂交在靶标序列上，因此两基团靠近，从供体到受体产生FRET发出荧光，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例．[26]检测时只检测受体基团发出的荧光；变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到荧光．该方法淬灭效率高，两条探针均与目的基因特异性结合才能检测到受体基团发出的荧光，检测的特异性增加．