酵母表达系统

酵母表达系统简介基因工程技术的核心是基因表达技术。基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。外源基因表达系统外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。外源基因表达系统基因表达载体受体细胞基因表达系统原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。酵母表达系统酵母（yeast）——是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。酵母菌的特点：基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。•选择标记营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。显性选择标记：可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的选择标记。•DNA复制起始区酵母表达载体包含两类复制起始序列：在大肠杆菌中复制的复制起始序列在酵母菌中引导进行自主复制的序列•表达盒表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表达载体的重要元件。启动子的长度一般在1～2kb，其上游含各种调控序列（如上游激活序列、上游阻遏序列、组成型启动子序列等），下游存在转录的起始位点和TATA序列（TATA序列可被质转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物）。一般在构建表达载体时须组入强启动子，如酵母磷酸甘油酯激酶（PGK）基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子等。分泌信号序列是前体蛋白N端一段长为17～30个氨基酸残基的分泌信号肽编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。常用的分泌信号序列有：α因子前导肽序列、蔗糖酶信号肽序列、酸性磷酸酯酶信号肽序列等。终止子序列相对较短，是决定酵母中mRNA3′端稳定性的重要结构。与高等真核生物类似，mRNA的3′端需经过前体mRNA的加工和多聚腺苷化反应。酵母基因表达载体的种类•自主复制型质粒载体（yeastreplicatingplasmid，YRP）该载体含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达200个，但经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。•整合型质粒载体（yeastintegrationplasmid，YIP）整合型质粒载体不含酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体DNA的同源重组主要有单交换整合和双交换整合两种方式。•着丝粒型质粒载体（yeastcentromericplasmid，YCP）该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有1～2个拷贝。该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个细胞内只有单拷贝，包含酵母染色体自主复制序列、着丝粒序列、端粒序列、酵母菌选择标记基因、大肠杆菌复制子和选择标记基因等。在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定。酵母菌选择标记基因SUP4表达时转化子菌落呈白色，不表达时呈红色。外源基因的插入可灭活SUP4基因，获得红色的重组转化子。YAC载体可插入200～800kb的外源基因片段，因而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。•酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）酵母基因表达系统宿主菌主要包括酿酒酵母巴斯德毕赤酵母乳酸克鲁维酵母多型汉森酵母•酿酒酵母它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早应用于外源基因克隆和表达的酵母菌。目前已表达了诸如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产物。其缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代谢和基因产物的表达。此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。•乳酸克鲁维酵母该酵母的遗传背景比较清楚，工业上用来发酵生产β-半乳糖苷酶。某些质粒载体可在该酵母中稳定的保存下来，不容易丢失。该酵母可表达分泌型和非分泌型重组异源蛋白，其表达水平和效果高于酿酒酵母。在分泌表达过程中，能形成正确的蛋白构象，因而利用其表达高等哺乳动物蛋白具有一定的优越性。目前已有多种外源蛋白在该酵母系统中得到表达，如人白细胞介素-1和β-牛凝乳酶等。•巴斯德毕赤酵母它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可在细胞中高水平积累。AOX1的启动子是一种可诱导的强启动子。以AOX1为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为受体细胞，可高效表达外源基因。在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了解还比较少，且发酵周期也比较长。CloningintothePichiaExpressionVectorsTransformationintoE.coliTransformingPichiaPreparingTransformingDNAScreeningforMut+andMutSTransformantsExpressionofRecombinantPichiaStrainsPCRAnalysisofPichiaIntegrantsPichiaExpression5'AOX1启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达；α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；HIS4为营养缺陷型筛选标志；3'AOX1基因片段能够与基因组AOX1基因同源重组；抗Amp基因和pBR322复制起始位点，使载体可在E.coli中筛选和复制。毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构SelectingaPichiaExpressionVectorpPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点SelectingaPichiaExpressionVectorPichiaCloning1.载体的3‘AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生同源重组表达载体与毕赤酵母基因组发生重组的方式：2.载体的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生同源重组GeneReplacementatAOX1inGS115MultipleGeneInsertionEventsCloning&TransforminginYeastCellsPichiapastoris甲醇酵母系统高效表达影响因素载体稳定性：是整合还是粘附到酵母染色体上基因剂量：单/多拷贝甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型)，Mut+(利用甲醇快型)mRNA5′端：应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构AT含量：AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构表达产物稳定性：分泌表达时，胞外蛋白酶是主要影响因素ThegrowthtemperatureofPichiapastorisis28-30℃forliquidcultures,plates,andslants.Growthabove32℃duringinductioncanbedetrimentaltoproteinexpressionandcanevenleadtocelldeath.Otherimportantfacts:•DoublingtimeoflogphaseMut+orMutSPichiainYPDis~2hours•Mut+andMutSstrainsdonotdifferingrowthratesunlessgrownonmethanol•DoublingtimeoflogphaseMut+Pichiainmethanolmedium(MM)is4-6hours•DoublingtimeoflogphaseMutSPichiainMMis~18hours•OneOD600=~5x107cells/mlNote：Growthcharacteristicsmayvarydependingontherecombinantstrain.GrowthofPichiaStrainsWhenplatesormediumcontainingmethanolareusedasgrowthmedium,itisadvisabletoaddmethanoleverydaytocompensateforlossduetoevaporationorconsumption.•Forplatesadd100µlof100%methanoltothelidoftheinvertedplate.•Forliquidmediumadd100%methanoltoafinalconcentrationof0.5%.GrowthonMethanolTostorecellsforweekstomonths,useYPDmediumorYPDagarslants.•StreakforsinglecoloniesofGS115,KM71,oraHis+transformantonYPD.•TransferonecolonytoaYPDstabandgrowfor2daysat30℃.•ThecellscanbestoredonYPDforseveralweeksat+4℃.Tostorecellsformonthstoyears,storefrozenat-80℃.•CultureasinglecolonyofGS115,KM71,oraHis+transformantovernightinYPD.•HarvestthecellsandsuspendinYPDcontaining15%glycerolatafinalOD600of50-100(approximately2.5-5.0x109cells/ml).•Cellsarefrozeninliquidnitrogenoradryice/ethanolbathandthenstoredat-80℃.StorageofPichiaStrainsStockSolutions10XYNB(13.4%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfatewithoutaminoacids)1.Dissolve134gofyeastnitrogenbase(YNB)withammoniumsulfateandwithoutaminoacidsin1,000mLofwater.Heatthesolution