微生物的遗传变异与菌种选育

第六章微生物的遗传变异与菌种选育第一节微生物遗传变异的物质基础第二节微生物的基因突变第三节微生物的基因重组质第四节微生物的菌种选育第五节微生物菌种的保藏和复壮第一节微生物遗传变异的物质基础种质连续理论：1883~1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌———小鼠死亡抽取心血分离活的S菌一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验（一）肺炎双球菌转化实验（transformation）：F.Griffith，研究对象：Streptococcuspneumoniae（肺炎双球菌）S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜（2）细菌培养实验热死S菌—————不生长活R菌—————长出R菌热死S菌+活R菌—————长出大量R菌和10-6S菌（3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液————长出大量R菌和少量S菌以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。（二）噬菌体的感染实验A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。（三）烟草花叶病毒的拆开与重组实验为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV）蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。二、遗传物质在细胞中的存在方式1.细胞水平2.亚细胞核水平3.分子水平一、基因突变基因突变（genemutation）简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-8~10-9范围内。第二节微生物的基因突变突变株的表型成因检出方法营养缺陷型因突变而丧失合成一补充培养基（auxotroph）种或几种生长因子的能力不能在基本培养基上生长突变株抗性突变型因突变而产生了对某药物培养基（resistantmutant）种化学药物或致死物理因子的抗性条件致死型突变后在某种条件下培养条件改变（conditional可正常生长、繁殖并lethalmutant）实现其表型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型一、基因突变的类型突变株的表型成因检出方法形态突变型因突变而产生的个体形态Morphologycal或菌落形态的非选择（常用颜色变化）mutant性变异抗原突变型因突变而引起的抗原借助于抗原antigenic结构发生改变抗体反应mutant其它突变型：毒力、糖发酵能力、代谢产物等二、突变的特点1.不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验）2.自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。3.稀有性：突变率低且稳定。4.独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。5.可诱发性：诱变剂可提高突变率。6.稳定性：变异性状稳定可遗传。7.可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变（forwardmutation），相反的过程则称为回复突变或回变（backmutation或reversemutation）。.诱发突变的机制诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。三、基因突变的机制碱基置换（substitution）定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（pointmutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类：转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；颠换（transversion），即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。直接引起置换的诱变剂一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起G┇C→A：T外，其余都是可使G┇CA：T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。移码突变移码突变（frame-shiftmutation）指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frameshiftmutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。丫啶类染料，如丫啶黄、丫啶橙和α-氨基丫啶等，都是移码突变的有效诱变剂。丫啶类化合物的诱变机制至今还不很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤–嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。染色体畸变（chromosomalaberration）某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）——染色体畸变，包括以下两个方面：染色体结构上的缺失（deletion）、重复（duplication）、易位（translocation）和倒位（inversion）染色体数目的变化。染色体结构上的变化染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；又如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。倒位是指断裂下来的DNA片段旋转180°后，重新插入到原来染色体的位置上；易位则指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。紫外线（U.V.，ultravioletray）对DNA的损伤嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物，其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。.自身突变的机制背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应微生物自身代谢产物的诱变效应互变异构效应环状突出效应第三节微生物的基因重组基因组：细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的DNA序列。一、原核生物的基因重组紧密缠绕的环状双链DNA分子遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子结构结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝基因组的重复序列少而短二、真核生物的基因重组DNA与组蛋白构成染色体有间隔子或内含子序列没有明显的操纵子结构含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复）遗传丰余：较高同源性的DNA重复序列第四节微生物的菌种选育在微生物工业应用中，微生物菌种工作主要包括以下四方面：①菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。②菌种培育：改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。③菌种的保藏：一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。④退化菌种的复壮：如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤采样增殖培养纯种分离纯培养生产性能测定方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1．稀释分离法2．平板划线分离法⑴涂菌：⑵划线分离：①分步划线法；②一次划线法：3．组织分离法测定代谢产物或其它目的性状（一）诱变育种的一般步骤和方法出发菌株同步培养使菌细胞处于相同或接近的生理状态单细胞（或单孢子）菌悬液的制备单细胞或单孢子的意义酵母或霉菌孢子106/ml、细菌108/ml诱变剂的选择及其剂量的确定以致死率为90％～99％为宜诱变处理①物理诱变剂②化学诱变剂确定出发菌株↓菌种的纯化选优↓←出发菌株的性能鉴定同步培养↓制备单细胞（或单孢子）悬液↓←活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验↓诱变处理↓平板分离↓计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养↓突变体的初步筛选↓←用简单快捷的方法重复筛选↓←摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）二、微生物的诱变育种二、微生物的诱变育种（二）变异菌株的初步筛选纸片培养显色法透明圈法琼脂块培养法1筛选用培养基⑴基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以‘[-]’表示；⑵在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；⑶在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表示。