微生物菌种选育

微生物菌种选育一、选种从自然界中选种从生产实践中选种定向培育优良菌株1、从自然界中选种采集菌样–土壤是微生物的“大本营”，所以土壤是首选的采集目标。–根据微生物的营养特性，有选择性地进行采集。在腐木和堆肥中纤维素和木质素分解菌较多在果实、蜜饯表面酵母菌较多在蔬菜、牛奶中乳酸菌较多在动物肠道和粪便中革兰氏阴性无芽孢厌氧菌和肠道细菌较多在谷物种子上曲霉、青霉和镰孢霉较多在油田、炼油厂附近的土壤中，石油分解微生物较多。富集培养（增殖培养）–利用选择性培养基的原理，在所采集的土壤等含菌样品中加入某些特殊营养物，并创造一些有利于待分离对象生长的条件，使样品中少数能分解利用这类营养物的微生物大量繁殖，从而有利于分离。在土样中加入一些石油以促使其中少数能利用石油作为碳源的微生物数量剧增。在土样中加入纤维素以富集纤维素分解菌纯种分离–平板划线分离法–平板表面涂布法–琼脂培养基浇注法。平板划线分离法涂布法琼脂培养基浇注法性能测定–细胞形态观察、菌落特征观察、生理生化鉴定等等2、从生产中选种在利用微生物进行大生产的过程中，微生物必然会以10-6左右的突变率进行自发突变，其中有可能出现一定几率的正突变株（指生产性状优于原始菌株的产量突变株）。这对长期在生产第一线、富于实际工作经验和善于细致观察的人们来说，是一种获得较优良生产菌株的良机。例如：有人在酒精工厂糖化酶产生菌Aspergillususamii（宇佐美曲霉）3758号菌株（产黑孢子）中，曾及时筛选到糖化力强、培养条件较粗放的白色孢子变种“上酒白种”等等。自发突变诱发突变正变→菌种进化（个别）进化性变异负变→菌种衰退（大量）退化性变异3、定向培育优良菌株定向培育：一种利用微生物的自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。例如：卡介苗是牛型结核分支杆菌的减毒活菌苗，可提高人体尤其是儿童对结核分支杆菌的免疫力，对预防肺结核具有显著效果。法国的A.Calmette和C.Guerin曾把牛型结核杆菌接种在含牛胆汁和甘油的马铃薯培养基上，前后花了13年功夫，连续移种了230多代，直至1923年获得成功。二、诱变育种诱变育种：利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。包括诱变和筛选两个环节，其中筛选更重要。1、诱变育种的基本环节存活率（%）=×100致死率（%）=×100cfucfu处理后每毫升数对照每毫升数cfucfucfu对照每毫升数处理后每毫升数对照每毫升数2、诱变育种的几个原则1.选择简便、有效的诱变剂–物理诱变剂：UV、激光；X射线、γ射线和快中子–化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物紫外线（UV）：一种最常用的物理诱变因素，功率15W，照射距离30cm。–作用机理：使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活作用，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并将照射处理后的微生物放在暗处培养。2.挑选优良的出发菌株（用于育种的原始菌株）–最好选用来自生产中的自发突变菌株–选用具有有利于进一步研究或应用性状的菌株，如生产快、营养要求低等–可选用已发生过其他突变的菌株–选用对诱变剂敏感性较高的增变变异株3.处理单细胞或单孢子悬液–目的：为使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯菌落，就要求作诱变剂的菌株必须以均匀而分散的单细胞悬液状态存在。4.选用最适的诱变剂量–各类诱变剂剂量的表达方式不同紫外线的剂量指强度与作用时间之乘积化学诱变剂的剂量指在一定外界条件下，以诱变剂的浓度与处理时间来表示。在育种实践中，通常以杀菌率作为诱变剂的相对剂量，多采用杀菌率为70~75%甚至更低（30~70%）的相对剂量。–在产量性状的诱变育种中，凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。5.充分利用复合处理的协同效应诱变因子的复合处理及其协同效应菌种单独处理复合处理诱变剂突变率%诱变剂突变率%土曲霉紫外线21.3X射线+紫外线42.8X射线19.7土曲霉氮芥0.1%不明显氮芥+紫外线11.0紫外线4.7链霉菌紫外线31.0紫外线+γ射线43.6γ射线35.0金色链霉菌二乙烯三胺6.06二乙烯三胺+紫外线26.6（2U-84）硫酸二乙酯1.78硫酸二乙酯+紫外线35.86紫外线12.5灰色链霉菌紫外线9.8紫外线+可见光照射1次9.7（JIC-1)紫外线+可见光照射6次16.66.利用和创造形态、生理与产量间的相关指标–为了确切知道某一突变株产量性状的提高程度，必须进行大量的培养、分离、分析、测定和统计工作，因此工作量十分浩大。如果能找到两者间的相关性，对育种效率的提高意义重大。–利用鉴别培养基的原理或其他途径，可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为可见的“形态”性状。例：观察和测定某突变菌落周围蛋白酶水解圈的大小→蛋白酶的活性大小；抗生素抑菌圈的大小→抗生素的抑菌能力鉴别性培养基（differentialmedium）：培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌菌落与外形相似的它种菌落相区分的培养基。•Pigmentedandnonpigmentedmutants•Antibiotic-resistantmutantswithintheinhibitionzone•Geneticmarker,suchastheexpressionofb-galactosidasethatproducesthebluecolor7.设计或采用高效筛选方案或方法1)初筛：以量（选留较多有生产潜力的菌株）为主，利用和创造形态、生理与产量间的相关指标，可在培养皿或摇瓶中进行。2)复筛：以质（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）为主，一般采用摇瓶培养或台式发酵罐进行发酵，然后对培养液进行分析测定，选出较理想的菌种。思考题设计从自然界中选育产高活力淀粉酶菌株的可行性方案。–选种：从面粉加工厂附近的土壤中采集–增殖培养：采用淀粉琼脂培养基培养，能水解淀粉的微生物可以生长，不能水解淀粉的微生物因缺少碳源不能生长。–分离纯化–向上述平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC比值），选取HC比值大的菌落进行再培养。–制备单细胞悬液–诱变育种–初筛：采用测HC比值，在培养皿上进行。–复筛：采用摇瓶培养，测定发酵液的蛋白酶活力Thankyou!