微生物遗传变异

第四章微生物遗传和变异目的要求：通过本章的学习，使学生掌握细菌基因重组，真菌基因重组和微生物诱变育种的基本原理和方法。要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理5、基因表达的调控重点：基因突变及修复、细菌的基因重组难点：低频转导，高频转导，准性生殖，基因表达的调控遗传：亲代与子代相似变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一遗传型：(genotype)表型：(phenotype)生物的全部遗传因子所携带的遗传信息具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。遗传型＋环境条件表型微生物是遗传学研究中的明星：微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。物种和代谢类型多样对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。第一节遗传的物质基础1、经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）一、三个证明核酸是遗传物质的经典实验1928年，F.Griffth的转化实验1944年，Avery的转化实验，确定了转化因子实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA！2、噬菌体感染实验实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。32P标记DNA35S标记蛋白质3、植物病毒TMV重建实验实验证明，TMV的遗传物质是RNA。朊病毒的发现和思考:朊病毒蛋白质是遗传物质？？？1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的2、细胞核水平真核生物细胞核核染色体原核生物核区DNA链核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质3、染色体水平真核生物染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构真核生物通常为多倍体原核生物的染色体只有闭合环状的DNA链原核生物为单倍体染色体的数目在不同的生物中是不同的4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。5、基因水平它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。1909年丹麦生物学家W．Johansen结构基因：是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶)及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：是位于启动子和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。重复基因：DNA片段重复跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因（IS因子、Tn因子）6、密码子水平7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位（二）微生物基因组结构的特点1、原核生物（细菌）的基因组1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短；2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；4）重复序列多；第一个完成基因组测序的真核生物基因组2、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组第一个完成基因组测序的古生菌1)只有40％的基因与其他两界的生物有同源性2)古生菌的基因组在结构上类似于细菌1.66x106bp的环状染色体DNA1682个ORF(OpenReadingFrame)3)负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似于真核生物（三）转座因子转座因子：细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段DNA序列。插入序列（insertionsequence,IS)转座子（transposon,Tn)某些病毒（Mu噬菌体）原核生物的转座因子：质粒通常不含有细胞初级代谢的遗传信息，而含有关于次级代谢的遗传信息质粒是独立存在于细菌染色体外或附加在染色体上的遗传物质。它由一共价闭合环DNA分子组成。（四）染色体外的遗传因子——质粒（Plasmid）1、致育因子(fertilityfactor,F因子)又称F质粒，一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株(相当于雌性)。F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称为高频重组菌株（highfrequencerecombination,简称Hfr)由于F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。质粒的类型:2、抗性因子(resistancefactor，R因子)另一类普遍而重要的质粒，主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗生素或其它药物呈现抗性。例如R1质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄青霉素(Ap)、卡那霉素(Km)。并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性质粒上。许多R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括碲(Te6+)、砷(As3+)、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等。在肠道细菌中发现的R质粒，约有25％是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占75％。3、细菌素质粒Col质粒含有编码大肠菌素的基因4、毒性质粒具有编码毒素的基因5、降解质粒携带有能降解某些物质的酶的基因6、共生质粒携带有与固氮有关的基因7、代谢型质粒控制某一特殊代谢过程8、隐蔽质粒此类质粒不显示任何表型效应，只有通过物理的方法检测其存在松弛型质粒（relaxedplasmid)：质粒在宿主中可以有10－100个拷贝，也称为高拷贝数质粒。严谨型质粒(stringentplasmid)：质粒在每个宿主细胞中只有1－4个拷贝，也叫低拷贝数质粒。窄宿主范围质粒：质粒的复制起点较特异，只能在一种特定的宿主细胞中复制。广宿主范围质粒：质粒的复制起点不太特异，可以在许多种细菌中复制。质粒的特点：1、不亲和性可以共存于同一细胞中的不同质粒彼此是亲和的，而不能共存于同一细胞的质粒彼此不亲和，质粒的这种特性称为不亲和性。2、可消除性3、能自我复制，稳定的遗传；4、没有质粒的细菌不能自发的产生质粒,但可以通过转化、转导或接合作用的转移获得质粒；5、质粒可以携带供体细胞的DNA转移。质粒的功能：2、可作为基因转移的载体。1、质粒控制细菌的某一遗传性状；第二节基因突变和诱变育种基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何可遗传的改变。基因突变狭义：点突变（一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换）野生型（原始性状）基因突变突变型（新性状）广义：基因突变和染色体畸变（大片段染色体的缺失、重复、倒位）一、基因突变的定义自发突变：在自然条件下发生的基因突变。诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变。回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态。基因突变分为二、基因突变的类型同义突变：碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的变化。错义突变：碱基序列的变化引起产物氨基酸的变化。无义突变：碱基的改变使得密码子变为终止密码子。移码突变：碱基的缺失或插入使翻译的阅读框发生改变，从而使氨基酸序列完全变化。不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：U常见的微生物突变体类型：1、营养缺陷型（auxotroph）特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记（突变株不能通过选择平板直接获得）缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型。影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫妇在1952年建立2、抗药性突变型（resistantmutant)由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的突变型。3、条件致死突变型(conditionallethalmutant)在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。4、形态突变型(morphologicalmutant)指造成形态改变的突变型。5、其他突变型1）自发性2）不对应性3）稀有性4）规律性三、基因突变的机制5）独立性6）可诱变性7）遗传性8）可逆性1、基因突变的特点：基因突变自发性和不对应性的实验证明：三个经典实验变量实验涂布实验影印实验证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。野生型（原始性状）特定环境突变型（适应环境的新性状）驯化定向诱变筛选？？？突变的原因？变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969变量实验（fluctuationanalysis）Newcombe的涂布实验（1949）影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin19582、自发突变的机制主要的原因是：碱基互变异构体的存在导致形成不同的碱基配对。腺嘌呤氨基式A－T配对腺嘌呤亚氨基式A－C配对碱基置换：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生转换：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换。颠换：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换。3、诱发突变的机制（1）碱基的置换（转换、颠换）（2）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误（3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位A、碱基类似物5－溴尿嘧啶（胸腺嘧啶结构类似物）4、诱变剂B、嵌入诱变剂C、与DNA碱基直接其化学反应的诱变剂D、辐射和热嘧啶嘧啶二聚体UV四、DNA损伤的修复1、光复活作用(photoreactivation)嘧啶二聚体嘧啶光解酶2、切除修复(excisionrepair)3、重组修复（复制后修复postreplicationrepair）4、SOS修复DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。错误倾向的SOS修复五、微生物诱变育种诱变育种：指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。（1）使用简便有效的诱变剂（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液诱变剂物理因素：紫外线、激光、离子束、X射线、γ射线等化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物（4）使用最佳的处理剂量致死剂量：将微生物全部杀死的剂量亚致死剂量：将M大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到1%，或者杀死90%以上，存活在10%以下。弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，如杀死50-70%，存活30%-50%，诱变处理一般选用亚致死剂量。处理剂量：是指处理因素对微生物的生物学效应剂量=强度（浓度）×作用时间相对剂量=杀菌率（5）设计高效率筛选方案诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）影印平板法生长谱法突变株的筛选：产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺