第六章真核基因在大肠杆菌中的表达

第六章真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素大肠杆菌表达体系克隆基因正确表达的基本条件克隆基因表达活性的检测1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。优越性：大肠杆菌表达体系1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。大肠杆菌表达体系大肠杆菌中表达体系的不足4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。大肠杆菌表达体系最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。克隆基因正确表达的基本条件具有核糖体结合位点；具有克隆基因的功能（强）启动子；插入序列的正确取向。克隆基因正确表达的基本条件1.微细胞检测法；2.巨细胞检测法；3.偶联反应测定法。克隆基因表达活性的检测这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。微细胞：指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。微细胞检测法克隆基因表达活性的检测通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开，含有质粒载体的微细胞是适于检测重组子质粒所携带的外源基因表达状况的理想体系。克隆基因表达活性的检测Example:ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）,在微细胞中不能合成出56103dal、42103dal、30103dal、28103dal四种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多肽分子。克隆基因表达活性的检测巨细胞检测法1.经紫外线照射的大肠杆菌recAuvrA细胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以继续合成，在紫外线照射后6小时，细胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右，在紫外线照射后的几个小时内，加入经放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因所编码的。克隆基因表达活性的检测2.将含有外源基因的λ噬菌体重组子，感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞经紫外线照射使DNA受到了损伤，自身基因的表达受到了严重的抑制。通过同λ噬菌体载体编码的蛋白质种类作比较，就可以鉴定出克隆基因编码的蛋白质产物。克隆基因表达活性的检测偶联反应测定法使DNA模板在细菌无细胞体系中，进行转录－转译偶联反应。经过改良的这种体系中，可以使克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的外源片断进行体外表达，就可以比较容易的确定多肽片断是由编码模板上的哪个小片段指导合成的。克隆基因表达活性的检测优点：1.放射性标记参入到蛋白质的效率，比体内标记法高的多，而且这个系统十分敏感。经35S标记的多肽分子，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若干小时后可被迅速检出；2.应用这个体系，其它原核生物的基因也能够得到有效的表达。go大肠杆菌表达载体核糖体结合位点启动子转录终止子复制起点组成部分最佳启动子具备的条件第一必须是启动子能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上1.启动子第二这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件第三这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。（IPTG）乳糖启动子Plac的可控性野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高PO基地水平转录阻遏蛋白乳糖异丙基β－D硫代半乳糖苷IPTG诱导高效转录PO乳糖启动子Plac的可控性野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5cAMPCAP高效转录Placo葡萄糖代谢cAMP浓度降低Placo基底水平转录PlacUV5o高效转录启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。2.转录终止子强化转录终止的必要性：外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tφ。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子也可以通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选强终止子的选择与使用筛选Apr、Tcs的转化子3.核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）核糖体结合位点的结构大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区5’端若干密码子的碱基序列4.转译增强子显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。5.转译终止子mRNA转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。1.选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌的染色体DNA，2.接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使克隆的片断恰好插入在紧邻报告基因的上游位置3.随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞，构成质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。功能启动子的分离：1.一般程序：报告基因（reportergene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据利用CAT基因进行功能启动子的分离和活性测定2.无启动子的CAT质粒载体EcoliDNA构建Ecoli基因文库细胞裂解物、14C标记得氯霉素乙酰辅酶A薄层层析放射自显影CAT活性的检测：氯霉素乙酰转移酶可以催化氯霉素（2-或3-）发生乙酰化作用。3.使用tetr作报告基因分离功能启动子1.首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、Hind位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点（pBRH3B,pBRH1），使之失活。2.将纯化的细菌染色体DNA片断，克隆在pBRH3B或pBRH1的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。4.使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。来源于pBR322转译终止密码子无启动子的galK原理：半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。分离功能的启动子：将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载体的MCS区的单克隆位点上；将体外连接的DNA重组分子，转化给具GalE＋、GalK－的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的干扰；将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆启动子的筛选pOK1质粒载体分离功能启动子的因素1.选用的报告基因galK的编码产物半乳糖激酶，是一种易于快速定量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活性的强弱）；2.应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。3.采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株（GalE+GalT+GalK－）作转化受体；5.启动子的构建Ptac=3Ptrp=11Plac1.Lac启动子的表达载体2.Trp启动子的表达载体3.PL启动子的表达载体常用的大肠杆菌表达载体理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后，人保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。1.经过Hae切割的203bp的酶切片断上具有Lac操纵子的控制区，包括阻遏物作用区、CAP作用区以及RNA聚合酶作用区、β-半乳糖苷酶的头8个密码子。有一些对阻遏物作用不敏感的启动子，也被用来制备表达载体2.95bp的Alu片断：不完整的CAP结合序列3.L8突变的203bp区段，在CAP结合序列里发生了G-A的转换4.在uv5突变，使lac启动子开始的转录显得更有效。（RNA聚合酶结合区T-A颠换,相邻碱基G-A的转换）质粒的构建：将含有lac启动子的Hae酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。增加2个碱基对2.T