第2章 中药制剂的鉴别

第二章中药制剂的鉴别本章重点：1、了解中药制剂的气相色谱、高效液相色谱定性鉴别的方法。2、熟悉中药制剂的性状鉴别、显微鉴别、荧光鉴别、可见—紫外光谱鉴别的方法。3、掌握如何建立中药制剂的薄层色谱定性鉴别方法。中药制剂的鉴别：是指利用一定的方法来确定中药制剂原料药的组成，从而判断该制剂的真伪。目的：检定制剂的真实性。方法：1、性状鉴别2、显微鉴别3、理化鉴别①化学反应法②升华法③光谱法④色谱法第一节性状鉴别中药制剂的性状是指除去包装后的性状。性状鉴别包括大小、色泽、表面特征、质地、气味等方面。制剂的性状能初步反映其质量状况。丸剂或有包衣的片剂还应描述除去包衣后的颜色和气味，硬胶囊剂写明内容物的性状。制剂色泽若是以两种色调组合的，描写时以后者为主。如棕红色，以红色为主。棕黄色，以黄色为主。一、性状鉴别的内容：颜色：从单一色到组合色不等，如红色、深褐色、红棕色等。形态：形态描述多种多样。同为液体，就可分为粘稠液体、液体、澄清液体、澄明液体等。形状：与制备模具有关，如栓剂有球形、鱼雷形、卵形、鸭嘴形等。气：可分为香、芳香、清香、腥、臭、特异、气微、芳香浓郁等。味：可分为甜、酸、苦、涩、辛、凉、咸、辣、麻等。其他：光泽感、滑腻感等也可用来描述性状。二、各种剂型的性状描述：在描述制剂性状时，应以中医药理论为指导。三、物理常数的测定：物理常数包括折光率、旋光度、比旋度、凝点、熔点、相对密度等。同一种物质，物理常数不变。测定物理常数不仅对药品具有鉴别意义，也反映药品的纯度，是评价药品质量的主要指标之一。显微鉴别是利用显微镜来观察中药制剂中原药材组织碎片、细胞或内含物等特征，从而鉴别制剂的处方组成。显微鉴别操作简单、直观、耗费少，是药典常用的鉴别方法之一。但现在应用越来越少。一、特点：1、在本鉴别中，只有药材原有组织结构特征能保留到制剂中，才有鉴别意义。故由溶剂提取的制剂，不能用此法进行鉴别。第二节显微鉴别2、中药制剂一般多由两味以上中药材制备而成，制剂中各原药材和辅料的显微特征会产生互相影响或干扰。应选择没有干扰又能表明该味药存在的显微特征作为鉴别依据。3、不同剂型其制片方法不同。二、制片方法：1、散剂、胶囊剂：取粉末，直接加甘油醋酸或水合氯醛透化装片。2、片剂：用刀片直接从药片断面刮取少量粉末或研碎后取少量样品透化装片。3、水丸、锭剂：研成粉末后取少量直接透化装片。4、蜜丸：取蜜丸切碎，加水搅拌，洗涤后，置离心管中离心分离沉淀。如此反复处理以除去蜂蜜后透化装片。三、应用实例：六味地黄丸的显微定性鉴别[显微鉴别]取本品置显微镜下观察，(1)薄壁组织棕色至黑棕色，细胞多皱缩，内含棕色核状物。(熟地黄)(2)果皮表皮细胞橙黄色，表面观类多多角形，垂周壁略连珠状增厚。(山茱萸)(3)淀粉粒三角状卵形或矩圆形，直径24—40um，脐点短缝状或人字状。(山药)3a草酸钙针晶束3b淀粉粒(4)草酸钙簇晶存在于无色薄壁细胞中中，有时数个排列成行。(牡丹皮)(5)不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛溶化；菌丝无色，直径4-6um。(茯苓)(6)薄壁细胞类圆形，有椭圆形纹孔，集成纹孔群。(泽泻)第三节理化鉴别中药制剂的理化鉴别：利用物理的、化学的或物理化学的方法对制剂中所含的化学成分进行定性鉴别，从而判断制剂的真伪。包括化学反应法、升华法、光谱法和色谱法等。其中以薄层色谱法最常用。一、化学反应法：是利用中药制剂中某一药味所含化学成分（有效成分或指标性成分）与适宜试剂发生化学反应，产生颜色或生成沉淀来作为该制剂鉴别依据的方法。(一)常用的鉴别反应按化学成分分有蒽醌类成分遇碱性试剂的呈色反应，黄酮类成分的盐酸——镁粉反应，香豆素和其它内酯类成分的异羟肟酸铁反应，皂苷类成分的L—B反应，氨基酸的茚三酮反应，糖类的а-萘酚浓硫酸反应、生物碱的碘化铋钾反应及鞣质和明胶的沉淀反应等。(二)化学反应鉴别法多在试管中进行，制剂样品要先制成适宜的供试液。制备供试液的常用方法如下：1、以50％-70％乙醇回流提取：提取出多数化学成分.2、以酸性乙醇回流提取：提取有机酸、生物碱等。3、以水提取：①室温浸泡：检验氨基酸、蛋白质。②60℃热水提取：检验单糖、多糖、皂苷、鞣质及其它苷类。4、以乙醚提取：①滤液检验酯、内酯、苷元。②药渣挥去乙醚，醇回流提取各种苷类。5、以升华法提取：升华的成分，如游离蒽醌苷元等。6、以水蒸气蒸馏法提取：挥发性成分。(三)一般化学反应法用于中药制剂鉴别应注意：(1)慎重使用专属性不好的分析反应，如泡沫生成反应、三氯化铁显色反应等。(2)在分析前对样品进行分离、精制，除去干扰分析反应的物质，借此改善鉴别方法的专属性。(3)采用阴性对照和阳性对照的方式，对拟定的鉴别方法进行反复验证，防止出现假阳性。二、升华法:又称微量升华法。可鉴别中药制剂中某些具有升华性质的化学成分。升华物具有以下四个条件之一，可用此法鉴别：1、在显微镜下观察具有一定的形状。2、在可见光下观察具有一定的颜色。3、在紫外灯下观察显出不同颜色荧光。4、加一定试剂处理后显出不同颜色或荧光。操作方法：取金属片安放在有圆孔(直径约2cm)的石棉板上，在金属片上放一小金属圈(内径约1.5cm，高约0.8cm)，对准石棉板上的圆孔，圈内放入预先研细成粉末的中药制剂一薄层，圈上覆盖载玻片，在石棉板下圆孔处用酒精灯缓缓加热，至粉末开始变焦，去火待冷，载玻片上有升华物凝集。将载玻片反转后，置显微镜下观察结晶形状、色泽，或取升华物加试液观察反应。三、光谱法：利用光谱法对中药制剂进行定性鉴别。主要包括荧光法、可见—紫外分光光度法，红外分光光度法。1、荧光法：①适用范围：组成中药制剂的中药材中含有能产生荧光的化学成分，在可见光、紫外光照射下能发出荧光，或经试剂处理后发出荧光。含有这类药材的中药制剂可用荧光法进行鉴别。②操作方法：取制剂的提取液点在滤纸上或试纸上，置可见光、紫外光灯下(365nm或254nm)观察或加一定的试剂后再进行观察。2、可见—紫外分光光度法：中药制剂含有芳香族或其它有不饱和共轭结构的化学成分，在可见—紫外光区有选择性吸收，可产生吸收光谱。共轭体系长短不同，导致吸光度不同,利用吸收光谱的特征即可鉴别制剂中某些成分。但制剂中成分的复杂性及吸收度的加和性，使这一方法专属性差。为提高专属性，可选择适当的方法将样品纯化后测定吸收光谱。此法分以下五种情况：规定吸收波长法：样品经适当处理后，测定其吸收光谱，在一定波长处有最大吸收。对照品对比法：最常用分光光度定性鉴别法。取对照品或对照药材及供试品经相同方法处理后，制成对照品溶液及供试品溶液，分别测定吸收光谱，比较二者吸收光谱的一致性。规定吸收波长和吸收度法：规定吸收波长和吸收度比值法：多溶剂光谱法：3、红外分光光度法：①在4000～400cm-1范围间测定中药制剂样品红外吸收光谱。②制样方法：取样品直接制样或溶剂提取后制样。③该法具有取样量少、快速、简便、准确等特点，但因仪器较少，目前用于中药制剂鉴别的报道不多。四、色谱法：包括薄层色谱法、纸色谱法、薄层扫描法、气相色谱法和高效液相色谱法。其中薄层色谱法最常用。(一)纸色谱：①以纸为载体，以纸上所含水或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。②用比移值（Rf）表示各组成成分的位置，因影响比移值的因素较多，故一般采用在相同实验条件下与对照物质对比的方法以确定其异同。（二）薄层色谱法：1、使用本法鉴定中药制剂，通常是在同一块薄层板上点入样品和适宜的对照物，采用同一条件依法层析展开，经显色或用其他方法检出色谱斑点后，将样品与对照物所得的色谱图进行对比，作出鉴定。2、在中药制剂的鉴别中，薄层色谱法为最常用方法。3、为了保证试验的重现性、准确度及分离度，薄层色谱法要进行规范化操作。（1）样品供试液的制备：①样品的提取：采用常用的提取方法，如冷浸法、回流提取法等，详见第一章。②供试液的净化：单一溶剂萃取法：用单一溶剂萃取。分段萃取法：利用药品各个部分不同的溶解度，用不同极性的溶剂分段萃取，达到样品供试液净化的目的。液—液萃取法：固—液萃取法：（2）薄层色谱法使用的材料：①薄层板：最好用厚度1～2mm的优质平板玻璃。规格：10cm×10cm、10cm×15cm、20cm×10cm或20cm×20cm。吸附剂或载体：最常用的是硅胶G(加有作为黏合剂的煅石膏)、另外还有硅胶GF254(硅胶G中加荧光剂)、硅胶H（不含黏合剂）、硅胶HF254(硅胶H中加荧光剂)等。有的吸附剂中还可加入作黏合剂的羧甲基纤维素钠、酸、碱或缓冲溶液等。②涂布器：手工、半自动两种薄层涂布器。涂布的厚度有固定厚度和可以调节的两种。③点样器材：定量点样毛细管：常用规格：０.５µL、１.０µL、２.０µL、３.０µL、４.０µL、５.０µL、１０µL。要求：标示容量准确，管端平整光滑，管壁洁净，液流通畅，无堵塞，无污染。微量注射器：应选用针尖平头适合薄层点样的。④展开箱（层析缸）：包括平底展开箱、双槽展开箱、水平式展开箱。⑤显色仪器：喷雾法：用喷雾瓶（在一定的压力下使试剂喷成均匀的细雾状）。通常用此法。浸渍法：用浸渍槽（将展开后的薄层板平稳放入有显色剂的浸渍槽内数十秒至１分钟后取出显色）。（3）操作方法：①薄层板的制备：将1份吸附剂（如硅胶G）加3份左右的水在研钵中用研杵沿一个方向充分研磨，调成均匀糊状物，倒入已准备好的涂布器中，在玻板上平稳地以直线方向移动涂布器，使硅胶浆均匀地涂布。薄层厚度一般为0.2～0.3mm，涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干，再于105～110℃活化约30分钟，置干燥器中备用。②点样：点样通常用定量微升毛细管，样点距离底边以1cm为宜，点间距离视情况为1、1.5或2cm，原点直径应不大于3mm；如样品容量较大，或为了改善分离度，也可点成宽约2～3mm不同长度的条带。点样时须注意尽量不要损害薄层表面。③展开：多采用上行展开，展开剂最初的前沿距原点约5mm，展开至规定展距后立即将薄层板取出，晾干，以备检测。多数品种展距7～9cm已够（普通10cm板）。少数需用长度为15或20cm的板，展距可适当延长至12～14cm。样品Rf值以0.3～0.7为最佳。通常是将薄层板与展开缸同时饱和，方法是首先将薄层板放在双槽展开缸的没有溶剂的一侧，待饱和后，将展开缸稍倾斜使展开溶剂从另一槽内流入放有薄层板的槽内，展开。饱和时间一般15～30分钟。展开用的溶剂需使用分析纯并于临用前配制，不可多次反复使用。展开剂如需分层，则放置分层后按要求分取上层或下层，备用。④检测：主要有三种方法：A、色谱斑点本身有颜色者可直接在日光下观察色谱中的色斑。B、色谱斑点在紫外光激发下可发射荧光者可直接置紫外光灯下观察荧光色谱。C、需加试剂方能显色或发射荧光者，则需将试剂均匀喷洒于薄层板面，直接观察、加热显色后观察或紫外灯下观察。含羧甲基纤维素钠的薄层板加热温度过高或加热时间过长易焦化，而加硫酸等显色剂也易造成板面炭化而影响显色效果，需要特别留意。⑷薄层色谱图记录与保存：因薄层色谱较难长时间保存，故显色后，尽快用照相、扫描或描画等方法保存色谱结果。⑸影响薄层色谱分析的主要因素：薄层色谱由于有同板同时检测多个样品，分析时间短，固定相（吸附剂）相对价廉，可即用即弃等优点而在中药分析方面被广泛使用。但另一方面，因为它是一种“敞开系统”的色谱技术，外界环境条件对被分离物质的层析行为影响很大；其次是由于分析的全过程是多步骤操作，所以操作技巧也明显的影响色谱质量。为了提高色谱的分离度和重现性，注意控制影响色谱质量的因素就显得非常重要。①样品的预处理及供试液的制备：中药的成分复杂，未知成分多，使供试液得以净化，往往是一个重要的有时甚至是关键的步骤。样品供试液净化的方法通常有单一溶剂萃取法、分段萃取法、液液萃取法、固液萃取法。应根据供试品的成分不同，选择适当的净化方法。②薄层色谱的点样技术：点样是薄层色谱的第一步，也是关键的一步，因为不良的点样是测定误差的最主要的来源。点样应注意：A、常规薄层板上原点的直径不大于3mm，高效薄层板要求原点直径不大于2mm。B、点样量不宜过大